(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211366063.X (22)申请日 2022.11.03 (71)申请人 北京理工大 学 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街5 号 (72)发明人 王颖　贾男　臧国伟　那雪梅　 李敬知　李春　 (74)专利代理 机构 北京领科知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 11690 专利代理师 徐丹丹　张丹 (51)Int.Cl. C12P 7/40(2006.01) C12N 1/16(2006.01) C12P 7/02(2006.01) A61P 29/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种熊果 酸的生产方法 (57)摘要 本发明涉及发酵工程技术领域， 具体提供了 一种熊果酸的生产方法， 包括两阶段发酵培养酿 酒酵母 （Saccharomyces  cerevisiae） ， 通过本申 请的生产方法获得了熊果酸产量在2331.44 ± 180.87mg/L及以上， 为加快推进 生物法合成熊 果 酸的生产工艺早日实现工业化应用提供示范作 用。 权利要求书2页 说明书8页 附图2页 CN 115505605 A 2022.12.23 CN 115505605 A 1.一种熊果酸的生产方法， 其特征在于， 所述的生产方法包括两阶段发酵培养酿酒酵 母 （Saccharomyces  cerevisiae ） ， 所述的两阶段发酵包括： 第一阶段： 以葡萄糖为 碳源， 以不含氨基酸的酵母氮源为氮源； 第二阶段： 以乙醇为 碳源， 以不含氨基酸的酵母氮源为氮源； 其中， 第二阶段中流加乙醇的时间为发酵的第40 ‑50h开始流加乙醇， 流加速率为28 ‑ 36mL/h。 2.根据权利 要求1所述的生产方法， 其特征在于， 所述发酵的第35 ‑45h开始加入半乳糖 作为诱导剂， 加入后， 半乳糖的终浓度为5 5‑65g/L。 3.根据权利 要求1所述的生产方法， 其特征在于， 所述发酵的第10 ‑12h开始流加葡萄糖 补料培养基， 且在3 5‑38h停止流加； 其中， 葡萄糖补料培养基每升包括： 400 ‑600g葡萄糖， 10 ‑15g不含氨基酸的酵母氮源， 1 ‑2g脱 落氨基酸混合物， 8 ‑10g KH2PO4， 2‑3g MgSO4， 3‑4g K2SO4， 0.2‑0.35g Na2SO4， 8‑12mL微量金 属溶液， 10‑15mL维生素 溶液。 4.根据权利 要求1所述的生产方法， 其特征在于， 所述发酵第40 ‑50h后每隔10 ‑12h加入 半乳糖补料培 养基、 维生素 溶液以及微 量金属溶 液； 其中， 半乳糖补料培养基每升包括： 400 ‑600g半乳糖， 10 ‑15g不含氨基酸的酵母氮源， 1 ‑2g脱 落氨基酸混合物， 8 ‑10g KH2PO4， 2‑3g MgSO4， 3‑4g K2SO4， 0.2‑0.35g Na2SO4， 8‑12mL微量金 属溶液， 10‑15mL维生素 溶液； 维生素溶液每升包括： 生物素0.01 ‑0.1g， 泛酸钙0.5 ‑2g， 烟酸0.5 ‑2g， 肌醇20 ‑30g， 盐 酸硫胺素0.5 ‑2g， 盐酸吡哆醛0.5 ‑2g， 对氨基苯甲酸0.1 ‑0.3g； 微量金属溶液每升包括： EDTA  10‑20g， ZnSO4•7H2O 5‑6g， MnCl2•4H2O 0.2‑0.4g， 无水 CuSO40.1‑1g， CoCl2•6H2O 0.2‑0.6g， Na2MoO4•2H2O 0.3‑0.8g， CaCl2•2H2O 2‑3.5g， FeSO4• 7H2O 2‑3.5g。 5.根据权利 要求1所述的生产方法， 其特征在于， 所述发酵的过程中pH维持5 ‑6， 温度维 持25‑35℃， 溶氧为30‑40%。 6.根据权利要求1所述的生产方法， 其特 征在于， 所述的生产方法包括： A） 菌种活化： 从 ‑80℃超低温冰箱中取出冻藏的甘油菌， 在SD缺陷型固体培养基上培养 至出现单菌落； B） 种子液培养： 挑取单菌落接种于种子培养基中， 在25 ‑35℃、 150 ‑250rpm的摇床中培 养30‑40h； C） 第一阶段发酵培养： 按照8% ‑12%的接种量接种于以葡萄糖为碳源， 以不含氨基酸的 酵母氮源为氮源的发酵初始培养基中， 在pH维持5 ‑6， 温度维持25 ‑35℃， 溶氧为30 ‑40%的条 件下培养， 待培养10‑12h开始流加葡萄糖补料培 养基， 且在第3 5‑38h停止流加； D） 第二阶段发酵培养： 以乙醇为碳源， 以不含氨基酸的酵母氮源为氮源， 其中， 流加乙 醇的时间为发酵的第40 ‑50h开始流加乙醇， 并且加入乙醇后， 控制乙醇的浓度维持5g以下； 其中， 在发酵的第35 ‑45h开始加入半乳糖作为诱导剂， 加入后， 半乳糖的终浓度为55 ‑ 65g/L； 并且在所述发酵第40 ‑50h后每隔10 ‑12h加入半乳糖补料培养基、 维生素溶液以及微 量金属溶 液； SD缺陷型固体培养基每升包括： 5 ‑8g不含氨基酸的酵母氮源、 15 ‑25g葡萄糖、 0.5 ‑1g脱权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115505605 A 2落氨基酸混合物， 琼脂粉15 ‑25g， 调节培 养基pH至6‑6.5； 种子培养基每升包括： 15 ‑25g/L不含氨基酸的酵母氮源、 50 ‑70g/L葡萄糖、 2 ‑3g/L脱落 氨基酸混合物； 发酵初始培养基每升包括： 50 ‑70g葡萄糖， 15 ‑25g不含氨基酸的酵母氮源， 2 ‑3g脱落氨 基酸混合物， 7 ‑10g KH2PO4， 2‑4g MgSO4， 0.5‑1g ZnSO4·7H2O， 8‑12mL微量金属溶液， 10 ‑ 15mL维生素 溶液， 培养基pH为5 ‑6。 7.根据权利要求1 ‑6任一所述的生产方法 ， 其特征在于 ， 所述的酿酒酵母 （Saccharomyces  cerevisiae ） 表达CYP450酶、 CPR酶、 甘油醛 ‑3‑磷酸脱氢酶和NADH依赖性 的羟甲基戊二 酸还原酶。 8.根据权利要求7 所述的生产方法， 其特 征在于， 其中， 所述的CYP450酶来源于枇杷； 所述的CPR酶来源于百 脉根； 所述的甘油醛 ‑3‑磷酸脱氢酶来源于 乳酸克鲁维酵母； 所述的NADH依赖性的羟甲基戊二 酸还原酶来源于 硅酸杆菌 。 9.一种同时生产熊果酸和α ‑香树脂醇的方法， 其特征在于， 所述的方法包括权利要求 1‑8任一所述 生产方法。 10.一种权利要求1 ‑9任一所述的生产方法或方法获得的熊果酸在制备抗炎症、 抗氧化 或抗肿瘤的产品中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115505605 A 3