ICS 65.020.20 B 38 团 体 标 准 T/SAIA 005—2021 绵羊痘和山羊痘荧光 PCR检测方法 Real-time PCR method for detection of sheep pox and goat pox 2021-12-20发布 2021-12-20实施 山东省农业产业化促进会 发布 全国团体标准信息平台 T/SAIA 005 —2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出 的规则起草 。 本文件由山东省农业产业化 标准委员会提出并 归口。 本文件起草单位：山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司 、滨州市农业技术 推广中心、 日照市东港区动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：王金良 、沈志强、唐娜、孟卫芹、高青华、魏凤、刘通、 许崇友、董林、 于新友、陈金龙、 姚春阳、 陈士运、李振伟 。 全国团体标准信息平台 T/SAIA 005 —2021 绵羊痘和山羊痘荧光 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了绵羊痘和山羊痘荧光 PCR检测的操作方法。 本文件适用于绵羊痘和山羊痘核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 54 1 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数 （Cycle Threshold） PBS：磷酸盐缓冲溶液（P hosphate Buffer S olution） 荧光 PCR：荧光聚合酶链式反应（ Real-time Polymerase C hain Reaction） DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic Acid） 4 仪器设备 4.1 二级生物安全柜。 4.2 荧光 PCR检测仪。 4.3 高速冷冻离心机：可控温至 4 ℃，离心速度可达 13 000× g以上。 4.4 普通冰箱： 冷藏 2 ℃～8 ℃、冷冻－20 ℃。 4.5 超低温冰箱：可控温至 -70 ℃以下。 4.6 变速组织研磨器。 4.7 单通道微量移液器：量程分别为 0.5 μL～10 μL、20 μL～200 μL 、100 μL ～1 000 μL 。 4.8 电子天平：精度为 0.01 g。 4.9 涡旋振荡器。 1 全国团体标准信息平台 T/SAIA 005—2021 4.10 高压蒸汽灭菌器。 5 试剂 5.1 除非另有说明外，本标准所用 检测试剂均为分析纯， 实验室用水应符合 GB/T6682 三级水的标 准。 5.2 无水乙醇： 室温放置。 5.3 75%乙醇：配制见附录 A.1，室温放置。 5.4 PBS：配制见附录 A.2。 5.5 引物和TaqMan探针：引物名称和序列见附录 B。 5.6 阳性对照：市售 山羊痘活疫苗株。 5.7 阴性对照：无山羊痘病毒感染的组织 。 6 样品的采集、运输及处理 6.1 采样注意事项 采样及样品处理过程中应戴一次性手套，样品间不得交叉污染。 6.2 样品采集 6.2.1 病料样品采集 取发病活体羊的皮肤丘疹 或病死剖检羊的肺、淋巴结等组织 5 g～10 g ，装入一次性塑料袋或其 他灭菌容器，编号标记， 置于样品冷藏箱送至实验室。在实验室生物安全柜内取出待检样品，加入 5倍体积 4 ℃预冷的 PBS中，充分研磨， 4 ℃、 3 000× g 离心 10 min，取上清液转入离心管中编号 备用。 6.2.2 细胞培养物 取1 mL细胞培养物置于离心管内，反复冻融 3次， 4 ℃、 3 000 ×g离心 10 min，取上清液转 入离心管中编号备用。 6.2.3 疫苗样品 随机抽取山羊痘活疫苗 样品 3瓶，分别加入 2 mL的PBS，溶解，混匀 ，4 ℃、 3 000 ×g离心 10 min，取上清液转入离心管中编号备用。 6.3 样品保存与运输 采集样品在 2 ℃～8 ℃条件下保存，时间应不超过 24 h；若需要长期保存，应放置 -70 ℃冰箱采 2 全国团体标准信息平台 T/SAIA 005 —2021 集的样品密封后，采用保温箱加冰密封，在 2 ℃～8 ℃条件下 24 h内运送到实验室。按《兽医实验 室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。 7 荧光PCR操作程序 7.1 DNA抽提 7.1.1 按以下步骤完成 DNA抽提或选 取商品化的病毒 DNA提取试剂盒进行 DNA抽提。 7.1.2 取n个灭菌 1.5 mL离心管，其中 n为待检样品＋阳性对照＋阴性对照，对每个离心管进行 编号。 7.1.3 每管加入 750 μL的DNAzol，再分别加入已处理的待检样品、 阳性对照、 阴性对照各 250 μL， 颠倒 5次混匀，涡旋震荡 10 s，于 4 ℃或室温 13 000 × g离心 10 min。 7.1.4 取与本标准 7.1.2 中相同数量的灭菌 1.5 mL 离心管，并对每个离心管进行编号。取本标准 7.1.3中离心后的上清液 900 μL置于上述 1.5 mL离心管中，加入 500 μL无水乙醇， 混匀，室温放置 3 min～5 min；4 ℃或室温 13 000 × g离心 5 min。 7.1.5 弃上清，沿管壁缓缓加入 0.8 mL～1 mL 75% 乙醇，颠倒 2次～ 5次混匀，室温放置 3 min～5 min；4 ℃或室温 13 000 × g离心 5 min。将离心管倒扣于吸水纸上 ，自然晾干或用移液器移去残液 。 7.1.6 每管加入 30 μL～50μL 的8 mmol/L NaOH 水溶液溶解沉淀 ， 轻轻混匀， 溶解管壁上的 DNA， 3 000× g离心 10 s，2℃ 7.2 荧光PCR检测 7.2.1 反应体系的配制 设荧光 PCR反应管数为 n，n为待检样品数＋阳性管数＋阴性管数，每个样本扩增反应体系配置 见附录 C，为了避免移液器取样损失， 建议按 n＋1个反应进行配制。 7.2.2 反应液的分装 将7.2.1中配制的荧光 PCR反应液充分混匀，按照每管18 μL分装于 PCR反应管内，按顺序加样并 做好标识，分装时尽量避免产生气泡。 7.2.3 加样 在各设定的荧光PCR 管中加入本标准 7.1制备的 2 μL DNA溶液，盖紧管盖后， 混匀后瞬时离心。 7.2.4 上机检测 将本标准 7.2.3中离心后的PCR管放入荧光PCR 仪内，记录样品摆放顺序 ，选择HEX 检测通道。 循环条件设置： 第一阶段，95 ℃ 预变性 180 s； 3 全国团体标准信息平台 T/SAIA 005—2021 第二阶段，95 ℃ 变性 5 s，退火、延伸、荧光采集 60 ℃ 20 s， 40个循环； 第三阶段，冷却 25 ℃ 20 s。 8 结果判定 8.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样 品扩增曲线的最高点为准。 8.2 质控标准 8.2.1 阴性对照：无 Ct值，且无典型扩增曲线。 8.2.2 阳性对照： Ct值<30.0，并出现典型的扩增曲线。 8.2.3 8.2.1和8.2.2要求需在同一次实验中同时满足，否则视为无效检验 ，需重新检测 。 8.3 结果描述及判定 8.3.1 被检样本检测结果中 HEX通道 Ct值≤38，且扩增曲线为典型的 S曲线，报告为羊痘病毒核 酸阳性；38< Ct值≤40，判定为可疑 ，可疑样品重新检测 ，如重复后仍然 38<Ct值≤40，且扩增曲 线均为典型的 S曲线，报告为羊痘病毒核酸阳性 。 8.3.2 被检样本检测结果中 HEX通道无 Ct值或无典型的 S型扩增曲线 ，报告为羊痘病毒核酸阴性。 4 全国团体标准信息平台 T/SAIA 005 —2021 附录A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 75%乙醇 取75 mL无水乙醇，加水至 100 mL，充分混匀后，保存备用。 A.2 磷酸盐缓冲液（ 0.01 mol/L ，pH=7.4） 取Na2HPO 4·12H 2O 2.9 g，KCl 0.2 g，KH 2PO 4 0.2 g，Na Cl 8 g，溶于 800 mL水中，充分搅拌 溶解，滴加浓盐酸将 pH调节至 7.4，然后加水定容至 1 0