ICS 6 5.020.20 B 38 团 体 标 准 T/SAIA 004—2021 猪瘟病毒 PPA-ELISA抗体检测方法 PPA-ELISA to detect antibod y against classical swine fever virus 2021 -12-20发布 2021 -12-20实施 山东省农业产业化促进会 发布 全国团体标准信息平台 T/SAIA 004 —2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出 的规则起草。 本文件由山东省农业产业化 标准委员会提出并归口。 本标准起草单位：山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司 、滨州市农业技术 推广中心、 日照市东港区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人： 王金良、沈志强、 孟卫芹、谢金文、 李娇、高青华、 董林、肖跃强、 刘通、 陈金龙、董 炳梅、许崇友、 姚春阳、魏凤、马力、李坤林 。 全国团体标准信息平台 T/SAIA 004 —2021 猪瘟病毒PPA-ELISA抗体检测方法 1 范围 本标准规定了猪瘟 病毒抗体PPA -ELISA检测方法 。 本标准适用于猪、兔等动物 猪瘟病毒抗体检测，但无法区分疫苗抗体和野毒感染抗体。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列缩略语适用于本文件。 CSFV：猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus ） ELISA：酶联免疫吸附试验 （Enzyme -Linked Immunosorbent Assay ） HRP：辣根过氧化物酶 （Horseradish Peroxidase ） SPA：葡萄球菌 A蛋白（ Staphylococcal Protein A） PPA：辣根过氧化物酶标记葡萄球菌 A蛋白（HRP -SPA） OD：光密度（Optical Density ） 4 设备和器材 4.1 微量移液器（最大量程分别为 10 μL、20 μL、100 μL 、1000 μL ）。 4.2 离心机（离心速度可达 6000 r/min 以上）。 4.3 37 ℃温箱。 4.4 酶标读数仪 （包括 450 nm波长）。 4.5 一次性注射器（5 mL ～10 mL）。 1 全国团体标准信息平台 T/SAIA 004—2021 5 试剂 5.1 猪瘟病毒 E2重组蛋白 克隆猪瘟病毒 E2抗原优势区基因，用 pET32a（+）表达载体进行表达，亲和层析法 纯化重组蛋 白。获得重 组蛋白纯度应 ≥95%。见附录 A。 5.2 标准阳性血清 猪瘟疫苗免疫仔猪制备， 免疫前荧光抗体病毒中和试验检测为阴性，免疫后猪瘟抗体正向间接 血凝效价达到 1：28以上。 5.3 标准阴性血清 无母源抗体、未免疫 猪瘟疫苗的仔猪 血清，经荧光抗体病毒中和试验检测为阴性。 5.4 包被液：见附录 B.1。 5.5 20×浓缩洗涤液：见 B.2。 5.6 封闭液：见 B.3。 5.7 样品稀释液：见 B.4。 5.8 HRP -SPA稀释液：见 B.5。 5.9 酶标结合物：商品化的 HRP标记的葡萄球菌 A蛋白。 5.10 底物液 A：见 B.6。 5.11 底物液 B：见 B.7。 5.12 终止液：见 B.8。 5.13 实验用水：符合 GB/T 6682 中三级水的 标准。 5.14 商品化试剂盒：可选择同类的商品化试剂盒。 6 血清样品的处理 6.1 样品采集及处理 采集静脉血时， 注射器不能重复使用，每头猪采血不少于 2 mL。待血液 室温自然凝固后 分离血 清，4 000 r/min 离心 3 min～5 min，用移液器吸出 100 μL的上层血清。 6.2 血清样本的存放与运送 血清样本若在一周内检测，可置 4 ℃冰箱中保存。若超过一周检测，应置 -20 ℃以下冷冻保存。 采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽量缩短。按照《兽医实验室 生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。 7 PPA-ELISA抗体检测操作方法 2 全国团体标准信息平台 T/SAIA 004 —2021 7.1 包被抗原 以纯化的 猪瘟病毒 E2蛋白做为包被抗原，用包被液稀释至 1 µg/mL，每孔加入 100 µL，4℃包 被16 h～18 h。包被结束后，弃去孔中液体 ，每孔加入 250 µL的1×洗涤液，振荡洗涤 2次，每次 2 min～3 min。 7.2 封 闭 每孔加入 200 µL封闭液，室温放置 2.5 h，弃掉孔内封闭液， 洗板同上 。 7.3 一抗孵育 在A1和A2孔中分别加入 100 μL阴性对照； 在 A3和A4孔中分别加入 100 μL阳性对照； 将待 检血清用样品稀释液 1:40稀释，每孔加入 100 μL，37 ℃温箱中反应 1 h，弃掉反应液， 洗板同上。 7.4 加HRP-SPA孵育 将辣根过氧 化物酶标记的葡萄球菌 A蛋 白（ HRP -SPA） 用稀释液稀释至工作浓度， 每孔加 100 μL， 37℃温箱中反应 1 h，弃掉反应液， 洗板同上。 7.5 加底物和显色 将底物液 A和底物液 B等体积混合，混合后立即加入到抗原包被板中，每孔 100 µL，37℃温箱 中反应 10 min。 7.6 终止反应 每孔加入 50 μL终止液终止反应。 7.7 结果判定 终止反应后 5 min内，在酶标仪上读取 450 nm吸光值 （OD 450），阳性对照 孔OD 450平均值≥0.6， 阴性对照 孔OD 450平均值＜0.3 ，试验成立 。待测样品孔 OD 450值≥2×阴性对照孔 OD 450平均值判为 阳性，反之判为阴性。 3 全国团体标准信息平台 T/SAIA 004—2021 附 录 A (规范性附录 ) 猪瘟病毒 E2抗原优势区基因克隆及表达 A.1 材料和试剂 猪瘟兔化弱 毒株（兔脾淋组织毒CVCC A V1412 ）；大肠杆菌感受态 细胞 DH5α、Rosetta（DE3）、 表达载体pET 32a（+）、 DNA Marker 、低分子量蛋白 Marker、 RNA提取试剂盒、RT -PCR扩增试剂、 T4 DNA Ligase 、Eco R I、Sal I限制性内切酶、 DAB底物显色液、 HRP -SPA均为商品化试剂。 A.2 引物序列 E2-F：5'- CGGA ATTC CGGCTAGCCTGCAAGGAAGAY -3'（Eco R I）； E2-R：5'- GCGTCGAC AGTCGTGTTRCCRATCAAGC - 3'（Sal I）。 A.3 方法 A.3.1 RT-PCR扩增与回收 以提取的病毒基因组 RNA为模板，加入如下 RT-PCR扩增体系： RT-PCR Mix （2×）10 µ L、上 下游引物各 1 μL、模板 RNA 2 μL、H 2O 6 μL，终体积为 20 μL。反应条件为： 42 ℃反转录 10 min； 95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，共32个循环； 72 ℃延伸 10 min， 4 ℃终止。将 786 bp的PCR产物片段用胶回收试剂盒回收，置于 -20℃保存备用。 A.3.2 重组载体的构建与鉴定 利用 EcoR I / Sal I双酶切 PCR产物和 pET32a（+）质粒，回收目的片段，插入表达载体 pET-32a （+）中，转化大肠杆菌（DH5 α）感受态细胞，双酶切鉴定 出阳性重组质粒 pET32a-E2。 A.3.3 重组蛋白的表达 与纯化 将测序正确的 pET32a-E2重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞 Rosetta（DE3）进行诱导表达及 SDS- PAGE鉴定分析。按照蛋白纯化试剂盒说明书纯化目的蛋白，蛋白大小约为 48 kDa；用紫外分 光光度计测定重组蛋白在 280 nm和260 nm波长的 OD值，计算蛋白浓度，纯化后的重组蛋白的 浓 度应≥ 1 mg/mL，分装后- 20℃保存。 A.3.4 重组蛋白纯度测定和特异性鉴定 取5 μL、2.5 μL、1 μL纯化产物进行 SDS-PAGE电泳，用 蛋白密度 扫描分析纯度，重组 蛋白纯 度应≥ 95%。同时用 猪瘟病毒阳性血清对纯化后的 E2蛋白进行 Western blot