ICS65.020.30 CCSA0311 NAASS 宁夏回族自治区农学会团体标准 T/NAASS058—2023 牛冠状病毒夹心法酶联免疫吸附试验抗原 检测技术规程 TechnicalspecificationfordetectionofbovinecoronavirusELISAantigenby sandwichmethod 2023-03-22发布 2023-04-25实施 宁夏回族自治区农学会  发布 全国团体标准信息平台 T/NAASS058—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 专利免责申明：本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由宁夏回族自治区科学技术厅提出。 本文件由宁夏回族自治区农学会归口。 本文件起草单位：宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、宁夏回族自治区畜牧工作站、同心县动 物疾病预防控制中心、固原市农产品质量安全监管中心、宁夏农林科学院动物科学研究所。 本文件主要起草人：李知新、周海宁、杨佳冰、艾文、李莉、马龙、王玉梅、白涛涛、吴亚文、封 元、梁小军、郭亚男、左新文、常耀祖、吴建宁、王磊、宋权儒、王晓亮、张玉玲、李杰、蒋秋斐。 全国团体标准信息平台 T/NAASS058—2023 1牛冠状病毒夹心法酶联免疫吸附试验抗原检测技术规程 1范围 本文件规定了牛冠状病毒夹心法酶联免疫吸附试验抗原检测的术语和定义、夹心法酶联免疫吸附试 验。 本文件适用于宁夏养牛场牛冠状病毒夹心法酶联免疫吸附试验抗原检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB/T19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛冠状病毒Bovinecoronavirus,BCV 牛冠状病毒属于冠状病毒科，是引起新生犊牛腹泻、成年牛呼吸道感染的重要病原。 3.2 夹心法酶联免疫吸附试验Sandwichenzymelinkedimmunosorbentassay,sELISA 夹心ELISA法是将已知的特异性抗体包被在固相载体上，加入待测样本和针对该抗原的酶标抗体， 其中的相应抗原即可与载体上的抗体和酶标抗体特异结合，洗去未结合的材料和酶标抗体，加入酶的底 物，由呈色反应来测定抗原。 4夹心法酶联免疫吸附试验 4.1试验准备 实验环境、仪器与设备、洗液的制备、稀释液的制备、示踪剂工作液的配制按照试剂盒说明书规定 执行。实验环境的生物安全条件应符合GB/T19489的要求，稀释用蒸馏水应符合GB/T6682的要求。 4.2检测样品 采集牛粪便样品加入等体积的样品稀释液，自然沉淀10min，无需离心，吸取粪便溶液的上清液于 1.5mL离心管中。 4.3操作程序 使用前将所有试剂恢复至18℃～24℃，轻轻摇动或旋转，使试剂混合均匀。 4.3.1取板 取出微孔板，并在操作记录表上标记样品的位置。如果使用微孔板的一部分，则只需取出足够检测 样品的条数。未使用的微孔板条用锡箔纸包好，保持干燥与密封，2℃～8℃保存。 4.3.2加样 全国团体标准信息平台 T/NAASS058—2023 2每孔加样品，A1与B1孔中加入样本1，C1和D1孔中加入样本2，以此类推。同样方法加入阳性对照（例 如G1和H1）。 4.3.3感作 将微孔板封板后，按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育。 4.3.4洗涤 弃去微孔板中液体，用300μL左右的洗涤液洗涤每个板孔3次。在每一次洗涤后，甩去每个板孔中 的液体，在洗涤时以及在加入下一步试剂之前要防止反应板出现干燥现象，避免孔内产生气泡，在最后 一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液体. 4.3.5加酶结合物 每孔加入酶结合物，摇匀。密封后按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育，按步骤4.3.4的 步骤进行洗涤。 4.3.6加底物 每孔加入底物溶液。加入孔中的底物溶液必须完全无色。按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温 避光孵育。 4.3.7加终止液 每孔加入终止液终止反应。 4.3.8测定吸光值（OD值） 酶标仪预热15min，在加入终止液5min内读取试剂盒说明书中指定波长的吸光度值（OD）。 4.4实验有效性检测 只有当满足试剂盒说明书规定的条件时检测才有效。 4.5结果计算 使用试剂盒说明书指定的计算公式进行结果计算。 4.6结果判定 使用试剂盒说明书规定的判定标准进行结果判定。 全国团体标准信息平台