ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广 东 省 地 方 标 准 DB44/T 2339—2021 实验动物 病原抗体液相芯片法定性分析 Laboratory animals Qualitative analysis of pathogen antibodies with suspension array method 2021 - 10 - 18 发布 2022 - 01 - 18 实施 广东省市场监督管理局 发 布 DB44/T 2339—2021 目 次 前言 ................................................................................. II 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 缩略语 ............................................................................. 1 5 原理 ............................................................................... 2 6 主要设备和材料 ..................................................................... 2 7 试剂 ............................................................................... 2 8 方法 ............................................................................... 4 9 结果 ............................................................................... 5 附录 A（资料性） 抗原的制备 ........................................................... 7 I DB44/T 2339—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广东省科学技术厅提出并组织实施。 本文件由广东省实验动物标准化技术委员会（GD/TC 93）归口。 本文件起草单位：广东省实验动物监测所。 本文件主要起草人：王静、袁文、闵凡贵、吴瑞可、朱余军、伍妙梨、徐凤姣、罗银珠、何丽芳、 练月晓、黄碧洪、张钰、丛峰、郭鹏举、黄韧。 II DB44/T 2339—2021 实验动物 病原抗体液相芯片法定性分析 1 范围 本文件规定了实验动物病原抗体的液相芯片定性分析方法。 本文件适用于基于液相芯片方法的实验动物病原抗体的定性分析。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 液相芯片技术 suspension array technology 液相芯片技术是基于编码微球和流式技术的一种临床应用型的高通量发光检测技术，又被称为流 式荧光术、悬浮阵列及xMAP技术等。它是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受 体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别识别微球编码和报告荧光来达到定性和定量的 目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高 通量多分子分析技术平台。 多重免疫荧光抗体检测 MFIA 在xMAP技术平台上建立的高通量抗体检测方法。通过将已知抗原偶联到不同编码荧光微球上，待测 物中的特异性抗体与荧光微球抗原发生特异性结合，抗原抗体复合物可与相应的二抗荧光报告分子结 合，最后通过荧光检测仪自动读取报告荧光和微球荧光编码，实现在同一个反应体系中监测多个靶抗体 的目的。 4 缩略语 BSA 牛血清白蛋白（bovine serum albumin） CPE 细胞病变效应（cytopathic effect） EDC 碳酰二亚胺（ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride） ELISA 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay） MFI 中位荧光强度值（median fluorescence intensity） 1 DB44/T 2339—2021 MFIA 多重免疫荧光试验 （multiplexed fluorometric immunoassay） PBS 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline） SA-PE 链霉亲和素-藻红蛋白 （streptavidin-R-phycoerythrin） SPF 无特定病原体（specific pathogen free） Sulfo-NHS 硫代琥珀酰亚胺（N-hydroxy sulfo succinimide sodium salt） xMAP 多分子分析技术（flexible multi-analyte profiling technology） 5 原理 液相芯片技术又称为微球悬浮点阵技术、流式荧光术、xMAP技术等，该方法以荧光微球作为反应载 体，从而可在液相实现对核酸、蛋白质等生物分子的高通量分析。其技术原理为将直径为5.6 µM的聚苯 乙烯小球用荧光染色的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最多可达100种具有不同 特征荧光谱的微球，然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分 子。加入待检样本后，在液相条件下，靶分子与微球表面交联的捕获分子发生特异性结合，在一个反应 孔内可以同时完成多达100种的不同反应。最后,微球随液流排成单列传送至液相芯片检测仪进行自动 分析，分析仪通过红、绿两束激光，其中635 nm/10 mW的红色二极管激光激发微球中的分类荧光染料， 确定被测物的特异性（定性）；532 nm/13 mW的钇铝石榴石激光（YAC）激发结合在微球表面的报告荧 光素（如藻红蛋白、Alexa532、Cy3等），确定被测物的量（定量），从而完成对反应的实时、定性和 定量分析。 6 主要设备和材料 液相芯片检测仪。 高速离心机。 药品保存冰箱（4 ℃）。 超低温冰箱（-80 ℃）。 漩涡振荡器。 离心管磁力架。 96 孔板磁力架。 96 孔板水平振荡器。 超声波清洗器。 真空抽滤装置。 96 孔细胞培养板。 蛋白低吸附离心管（1.5 mL）。 微量移液器：0.1 µL～2 µL，1 µL～10 µL，10 µL～100 µL，100 µL～1000 µL。 7 试剂 抗原 7.1.1 天然抗原 2 DB44/T 2339—2021 7.1.1.1 特异性抗原：将病毒接种至敏感细胞培养增殖（见附录 A 中的附表 A.1），当细胞病变达+++～ ++++时收获，冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液经超速离心浓缩，再进行蔗糖 密度梯度离心，收集纯化抗原蛋白带，制成检测抗原。 7.1.1.2 细胞对照抗原：未接种病毒的相应细胞冻融破碎后，经低速离心去除细胞碎片而获得的上清 液。 7.1.2 重组抗原 7.1.2.1 特异性重组抗原：选取免疫原性较好的抗原片段通过基因克隆表达及纯化获得重组抗原（见 附录 A 中的附表 A.2），加入蛋白保护剂，分装保存于-80 ℃超低温冰箱待用。 7.1.2.2 表达系统对照抗原：将选用的表达系统按照同等诱导条件诱导空载体蛋白表达，收获空载体 诱导菌，超声裂解，离心取裂解上清作为表达系统对照抗原。 二抗 二抗应选用以下两种之一： a) 生物素标记羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬或猴 IgG 抗体。用于检测相应动物血清 抗体； b) 藻红素偶联的生物素标记羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬或猴 IgG 抗体。用于检测 相应动物血清抗体。 SA-PE 链霉亲和素-藻红蛋白SA-PE。 荧光微球 表面带有羧基的特定编码荧光微球MagPlex Microspheres。 磁珠偶联试剂 硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）； 碳酰二亚胺（EDC）； 激活缓冲液（Activation buffer）：0.1 M NaH2PO4，pH6.2； 偶联缓冲液（Coupling buffer）：50 mM MES，pH5.0 ； 储存缓冲液（PBS–TBN buffer）： PBS，0.1%BSA，0.02%Tween-20，0.05%Sodium azid。 xMAP 反应液 磷酸盐缓冲液（PBS）：138 mM NaCl，2.7 mM KCl，pH7.4； 反应液/洗液（Assay/Wash buffer）：PBS，1%BSA，pH7.4。 对照血清 7.7.1 阳性血清 用特异抗原免疫SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通级兔、犬、猴所获得的抗血清；或自然感染恢 复后的犬、猴血清。 3 DB44/T 2339—2021 7.7.2 阴性血清 SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清；或确认无相应病原感染的兔、犬、猴血清。 注： 以上所用的试剂除特别注明者外均为分析纯，实验用水为双蒸水或去离子水，应符合GB/T 6682所规定一级水 的要求。 8 方法 样品前处理 无菌采集动物血液约0.1 mL～0.5 mL，37 ℃放置1 h，或者4 ℃冰箱放置过夜，5 000 g离心5 min， 分离上清