ICS 65.020 B 39 DB52 贵 州 省 地 方 标 准 DB52/T 1445—2019 冬荪液体菌种生产技术规程 Rules of production-technique about liquid strain of Dong sun 2019 - 11 - 11 发布 贵州省市场监督管理局 2020 - 01 - 01 实施 发 布 DB52/T 1445—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 生产技术要求 ...................................................................... 2 5 摇瓶液体菌种生产技术 .............................................................. 3 6 发酵罐菌种生产技术 ................................................................ 4 7 放罐接种 .......................................................................... 6 8 记录和存档 ........................................................................ 6 9 液体菌种贮藏 ...................................................................... 7 附录 A（资料性附录） 冬荪液体菌种培养基配方 .......................................... 8 附录 B（资料性附录） 冬荪液体菌种 .................................................... 9 I DB52/T 1445—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由贵州省农作物品种资源研究所提出。 本标准由贵州省食用菌标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：贵州省农作物品种资源研究所、贵州省食用菌育种重点实验室、贵州利康农科技 有限公司、黔西南州利康农科技发展有限公司、大方县丽军林下种植中药材专业合作社、贵州乌蒙腾菌 业有限公司。 本标准主要起草人：黄万兵、桂阳、张丽娜、朱国胜、刘宏宇、卢颖颖、龚光禄、杨通静、王沁、 陈娅娅、胡腾文、王万军、潘成、尚念杰。 II DB52/T 1445—2019 冬荪液体菌种生产技术规程 1 范围 本标准规定了冬荪（Phallus impudicus、Phallus fragrans、Phallus flavocostatus）液体菌种生产术语 和定义、摇瓶液体菌种生产技术、发酵罐菌种生产技术、放罐接种、记录和存档、液体菌种贮藏。 本标准适用于冬荪液体菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 150.2 压力容器 第2部分:材料 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728 食用菌术语 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 2375 食用菌生产技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 冬荪 Dong Sun 是白鬼笔Phallus impudicus、重脉鬼笔Phallus flavocostatus和香笔菌Phallus fragrans的统称，又称无 裙竹荪，隶属于真菌门（Eumycota）、担子菌亚门（Basidiomycotina）、腹菌纲（Gasteromycetes）、 鬼笔科（Phallaceae）、鬼笔属（Phallus）。 3.2 液体菌种 liquid spawn 用于生产和销售的菌丝体及其生长基质组成的液体繁殖材料，包括摇瓶液体菌种、发酵罐菌种。 3.3 液体菌种发酵罐 cultivation apparatus for liquid spawn 进行液体菌种培养的专用设备。 1 DB52/T 1445—2019 3.4 液体菌种接种器 liquid interface trap inoculator 将液体菌种从发酵罐中按无菌操作要求转接到固体培养基物料上的设备。 3.5 固体专用种 solid special spawn 在玻璃试管/平皿上固体培养基内生长的纯菌丝体培养物，专供接入液体培养基使用。 4 生产技术要求 4.1 液体菌种生产厂房 4.1.1 液体菌种生产场址要求 液体菌种生产厂房设计达到GB 50073的规定。液体菌种生产场址应建在交通方便，水源和电源充足， 无有害气体、烟雾、灰沙，远离垃圾场、畜禽场舍等有污染的地方，且道路路面硬化、排水良好。 4.1.2 液体菌种生产车间要求 4.1.2.1 液体菌种生产车间地面应能防水、防滑、防腐蚀、防渗漏、易清洗，有适当的排水坡度（1.0%～ 1.5%）和良好的排水系统，排水沟应是圆弧式的明沟。墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。 门窗应设置防蚊蝇纱网。车间入口处应设置洗手、消毒和干手设施。车间安装排气管道或者排风设备， 设封闭式废物桶。 4.1.2.2 发酵间、接种间按照 GB 50073 执行。液体菌种接种间应设置缓冲间。灭菌间、冷却间、培养 间符合 NY/T 2375 的规定。 4.2 生产设备与设施 4.2.1 主要生产设备 包括液体菌种发酵罐、空气压缩机、高效空气过滤器、液体菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅 炉、净化工作台、恒温摇床、恒温培养箱、除湿机、玻璃三角瓶、玻璃平皿、自备电源（发电机）等。 液体菌种发酵罐、高压灭菌锅和蒸汽锅炉应符合GB 150.2的规定；高效空气过滤器：对粒径0.1 μm～ 0.2 μm粒子的捕集效率在99.999%以上，且所有材质应耐126℃高温灭菌；玻璃三角瓶容积 250 ml～5000 ml、耐126 ℃高温灭菌。 4.2.2 主要基础设施 液体菌种生产车间应包含配料间、灭菌室、冷却间、接种间、培养间、发酵间、化验室、菌种室等， 并配备相应设施设备。 4.3 培养原料 化学试剂类、生物制剂及天然材料类应符合NY/T 2375要求，同时水不溶物物料需过100目筛。 4.4 生产菌种 生产菌种符合NY/T 2375要求，术语符合GB/T 12728的规定。 2 DB52/T 1445—2019 4.5 液体菌种生产工艺流程 冬荪液体菌种生产工艺流程见图1。 木材粉碎 原料贮存 配料 采购辅料 拌料 装袋 检验检测 灭菌 冷却 固体专用种 摇瓶 10-15 天 10-15 天 摇瓶种 发酵罐 接种栽培种 检验检测 冷却 冷却 灭菌 灭菌 分装 分装 配料 配料 图1 5 （菌棒） 冬荪液体菌种生产工艺流程 摇瓶液体菌种生产技术 5.1 液体培养基配方及制作 5.1.1 液体培养基配方 液体培养基配方见附录A：葡萄糖10 g、磷酸二氢钾0.9 g、硫酸镁1.8 g、马铃薯360 g（切薄片煮汁）、 酵母粉0.5 g、蛋白胨2.5 g、VB1 0.03 mg，自来水补足至1 L。 5.1.2 分装 摇瓶液体培养基分装量应为摇瓶容积的60%。 3 DB52/T 1445—2019 5.1.3 灭菌 液体培养基配制分装后应立即灭菌。灭菌条件：0.120 Mpa～0.140 Mpa、温度达121 ℃时，高压蒸 汽灭菌30 min。 5.1.4 冷却 冷却室使用前要进行清洁和除尘处理。将灭菌后摇瓶液体培养基放置在冷却室中，冷却到液体培养 基降温至室温（≤25 ℃）。 5.1.5 接种 在净化工作台上严格按无菌操作规程，将合格的冬荪固体专用种接种到摇瓶液体培养基中（接种量 的质量比为1%～3%）。接种完成后及时贴好标签。 5.2 培养 5.2.1 培养条件 在使用培养室的前两天，采用药物或者紫外灯消毒。摇瓶液体菌种应置于摇床上震荡培养，震荡频 率150 r/min，恒温25 ℃。 5.2.2 培养期检查 摇瓶液体菌种培养期间应定期检查，及时拣出不合格菌种。 5.2.3 入库与记录 10 d～15 d后，完成培养的摇瓶液体菌种应登记入库。摇瓶液体菌种生产各环节应详细记录。 5.3 留样 冬荪固体专用种应留样备查，留样的数量应以每个批号3～5 支，于4 ℃下贮存，贮存至经发酵罐菌 种转接的栽培种（菌棒）出菇结束。 6 发酵罐菌种生产技术 6.1 空气过滤器的检查与灭菌 6.1.1 检查 使用前应拆分检查空气过滤器滤芯，要求无油污、料污、无破损，外壳内外壁要求无污物、光亮洁 净。 6.1.2 灭菌 检查完后空气过滤器应高压蒸汽灭菌，灭菌条件：0.120 Mpa～0.140 Mpa、温度达121 ℃时，高压 蒸汽灭菌30 min。 4 DB52/T 1445—2019 6.2 发酵罐检查与清洗 6.2.1 检查 检查罐上全部阀门，安全阀、压力表、要求完好，工作正常。 6.2.2 清洗 对罐体内、外和全部阀门用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物的洁净程度。 6.2.3 空消 发酵罐初次使用、出现染菌、长期放置、更换品种时，都要求利用外源蒸汽空消进行灭菌。灭菌条 件：发酵罐罐体压力0.120 Mpa～0.140 Mpa、温度达121 ℃时，高压蒸汽灭菌30 min。 6.3 发酵罐菌种培养基要求与制作 6