SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4723—2016 根结线虫属（非中国种）检疫鉴定方法 Detection and identification of Meloidogyne spp.(non-Chinese species) 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4723—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫 局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、南京农业大学、华南农业大学。 本标准主要起草人：顾建锋、王金成、何洁、张慧丽、王暄、李芳荣、林宇、卓侃。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4723—2016 根结线虫属（非中国种）检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了根结线虫Meloidog.yne中国种与非中国种的检疫鉴定方法 本标准适用于进出境植物、植物产品、土壤和介质等传带的根结线虫的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T24829毛刺线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程 SN/T 2117 伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法 3根结线虫属线虫基本信息 学名：MeloidogyneGoeldi,1887 英文名：Root-knot nematodes 分类地位：垫刃目（Tylenchida），垫刃总科（Tylenchoidea），纽带科（Hoplolaimidae），根结亚科 （Meloidogyninae），根结线虫属（Meloidogyne）。 传播途径：带线虫根组织、球根、球茎和被污染的土壤都是根结线虫传播的主要载体。远距离传播 主要借助于受侵染的植物繁殖材料的调运；农事操作中农机具和人员等的黏带以及灌溉和风雨运动可 造成近距离扩散。 根结线虫属其他相关信息参见附录A。 根结线虫属线虫为植物根系、球根球茎等地下组织的专性内寄生线虫，其寄主及分布范围均十分 广泛。目前该属已知线虫98种，其中最常见的是南方根结线虫M.incognita、花生根结线虫 M.arenaria、爪哇根结线虫M.javanica、北方根结线虫M.hapla和象耳豆根结线虫M.erterolobii，我 国已有记录近40种，其中23种确定为中国种（参见附录B）。 4方法原理 根结线虫二龄幼虫线形，在根及根围土壤中活动，入侵寄主根部后固着寄生，逐渐发育为卵圆形雌 虫，导致寄主根部膨大呈根瘤状。因此，如发现疑似根结，可直接部检获得雌虫，也可从寄主植物根系及 根围土壤或介质中分离获得二龄幼虫或雄虫。获得线虫后，根据其雌虫、雄虫和二龄幼虫形态，判别其 是否为根结线虫属，然后进一步用形态学和分子生物学相结合的方法，并参考其寄主、地理分布等信息， 判断其种类。 目前已经报道的根结线虫共98种，其中40种在我国曾有报道。根据文献报道频次、分布是否广 泛、描述是否充分等，将其中23种作为中国种，其余17种是否为中国种有待进一步核实。若判断其非 1 SN/T 4723—2016 该方法所述的23种中国种之一，根据检疫风险原则，可判定为非中国种，并应联系有关鉴定专家进行 鉴定。 5器材和试剂 5.1仪器设备和器具 PCR仪、冷藏箱、体视显微镜、生物显微镜、超低温冰箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌 锅、微波炉、烘箱；漏斗、医用解剖刀、载玻片、盖玻片、酒精灯、线虫挑针、PCR管、24孔细胞培养板、可调 式微量移液器（2μL～1000μL)及相应的吸头。 5.2 主要试剂 除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 甲醛、乙醇、甘油、蜡块、指甲油、2XTaqMasterMix预混液、1oXEasyTaq缓冲液、蛋白酶K （20mg/mL）、无RNase无菌水、100bpMarker、EB染料、50XTAE溶液、琼脂糖凝胶 6现场检疫与取样 6.1症状检查 现场检疫时应挖取寄主植物根部，观察根上是否有根结或疙瘩状变异，或生长不良、腐烂、变色、畸 形等症状。 6.2取样 按照SN/T2117进行抽样和取样，对有根结等症状的重点取样。如无症状，则随机取样。对于进 境苗木，如数量≤5株，要求对每株单独取1份样品。每份样品重量≥0.5kg，取样深度为20cm左右， 要求多带些根。数量>5株，则要求取样5份以上。样品置密闭塑料袋中，标明品名、报检号、来源国、 查根部。土壤、介质或其他植物产品可参照该方法。 业标准信 7实验室检验 7.1线虫分离 实验室接到样品后应立即进行线虫分离。若不能及时分离，可将样品暂时保存于4℃冷藏箱中。 土壤、介质等可用改良漏斗法分离线虫（见GB/T24829），根结可直接检分离线虫（见SN/T2117）。 7.2体视显微镜镜检 根结线虫二龄幼虫较细小，体长多在400um～500um，行动迟缓，虫体一般内容物较多，颜色偏 深。雄虫体长达1500μm，行动迟缓。雌虫须部开根结才能看到，呈球形或近梨形，长500um～700μm， 宽300μm500μm，乳白色半透明状。 7.3标本制作 若镜检发现二龄幼虫或雄虫，需制作临时玻片或永久玻片（见GB/T24829）。若发现雌虫，应制作 会阴花纹永久玻片（见SN/T2117）。