SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.8—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第8部分：志贺氏菌 Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection—Part 8 :Shigella 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4624.8—2016 前言 SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分： 第1部分：地衣芽孢杆菌； 第2部分：短小芽孢杆菌； 第3部分：巨大芽孢杆菌； 一第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌； 第5部分：β型溶血性链球菌； 第6部分：金黄色葡萄球菌； 第7部分：沙门氏菌； 第8部分：志贺氏菌； 第9部分：致泻大肠埃希氏菌； 第10部分：淡紫拟青霉； 第11部分：雅致小克银汉霉； 第12部分：哈茨木霉； 第13部分：黄孢原毛平革菌； 第14部分：焦曲霉； 第15部分：解淀粉芽孢杆菌； 第16部分：类产碱假单胞菌； 第17部分：恶臭假单胞菌。 本部分为SN/T4624的第8部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：王金玲、栾慎顺、钟钰、于丽、金学典、王芳。 标准信息服务平台 1 SN/T4624.8—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第8部分：志贺氏菌 1范围 SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的形态学鉴定、生化鉴 定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。 本部分适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验志贺氏菌的检测和鉴定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 主要试剂和培养基 3 实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 3.2 生理盐水：见附录A中A.1。 3.3 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：见A.2。 3.4 麦康凯（MAC）琼脂：见A.3。 3.5 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XLD)琼脂：见A.4。 3.6 志贺氏菌显色培养基：见A.5。 3.7 三糖铁(TSI)琼脂：见A.6。 标准信息服务平台 3.8 营养琼脂斜面：见A.7。 3.9 半固体琼脂：见A.8。 3.10 葡萄糖铵培养基：见A.9。 3.11 尿素琼脂：见A.10。 3.12 β-半乳糖苷酶培养基：见A.11。 3.13 氨基酸脱羧酶试验培养基：见A.12。 3.14 糖发酵管：见A.13。 3.15 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见A.14 3.16 蛋白陈水、靛基质试剂：见A.15。 3.17 志贺氏菌属诊断血清。 3.18 生化鉴定试剂盒。 3.19 TE缓冲液（pH8.0）：见A.16 3.20 溶菌酶(10mg/mL)：见A.17。 3.21 蛋白酶K(20mg/mL)：见A.18。 3.22 10%SDS:见A.19。 1 SN/T4624.8—2016 3.23 3mol/L乙酸钠：见A.20。 3.24 dNTP:dATP,dTTP,dGTP,dCTP。 3.25 TBE:见 A.21。 3.26 Taq DNA聚合酶。 3.27 细菌基因组DNA提取试剂盒。 3.28 琼脂糖。 3.29 溴化乙锭。 3.30 DNA分子量标记：100bpDNAladder。 4 主要仪器和设备 4.1 电子天平（感量0.01g）。 4.2恒温培养箱：36℃±1℃。 4.3恒温水浴锅。 4.4台 台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 4.5 5PCR扩增仪。 4.6实时荧光PCR仪。 4.7 微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000μuL。 4.8 高压灭菌锅。 4.9 9PCR超净工作台。 4.10 电泳仪。 4.11 核酸/蛋白分析仪。 4.12 凝胶成像系统。 4.13 无菌培养皿：直径90mm。 5样品制备 以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混匀，从中移取25mL加人到225mL灭 准信息服 6形态学及生化鉴定 6.1增菌 将上述样品匀液吸取25mL，接种于225mL志贺氏菌增菌肉汤中，经41.5℃±1℃厌氧培养 16 h~20 h。 6.2分离 取增菌后的志贺氏菌增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培 养基平板上，于36℃土1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单 个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行 观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。 2