SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4732—2016 香蕉细菌性萎蕉病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Xanthomonas campestris pv. musacearum 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4732—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：冯建军、汪莹、章桂明、龙海、吴绍精、王红英， 行业标准信息服务平台 1 SN/T4732—2016 香蕉细菌性萎蕉病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了香蕉细菌性萎為病菌（Xanthomonascampestrispv.musacearum）的检疫鉴定方法。 本标准适用于香蕉茎、叶、果实等组织材料中香蕉细菌性萎為病菌的检疫和鉴定。 2 2香蕉细菌性萎蕉病菌基本信息 学名：Xanthomonas campestrispv.musacearum（Yirgou&.Bradbury1968）Dye1978 异名:Xanthomonas vasicola pv.musacearum Aritua et al 2008 病害英文名：Bananaxanthomonaswilt 分类地位：原核生物界（Procaryotae）、变形菌门（Proteobacteria）、-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、 黄色单胞菌目（Xanthomonadales）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）、黄单胞菌属（Xanthomonas）。 远距离传播主要途径为带菌的果实、叶等植物材料以及昆虫的传播。 其他资料参见附录A。 3 3方法原理 本标准主要依据香蕉细菌性萎焉病菌为害症状、菌落形态特征、生理生化特征、致病性特性以及 GspD基因特性和小分子多肽靶标分子标记特性等相关信息而制订。 4 仪器、用具及试剂 4.1仪器 PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、 电泳仪、凝胶成像系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS)。 4.2用具 息服务平台 杯、酒精灯、镊子等。 4.3试剂与培养基 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 培养基和试剂配方见附录B、附录C、附录D和附录E。 5检疫鉴定 5.1现场检疫 5.1.1症状观察 仔细检查，现场对香蕉叶、茎以及果实等组织材料进行症状观察，症状描述参见A.4。 1 SN/T 4732—2016 5.1.2样品抽取 发现可疑样品，切除受害部位组织或整棵植株带回实验室检测。 5.2实验室检测鉴定 5.2.1病原菌分离 洗2次，再加适量无菌水浸泡15min～20min。用接种环蘸取浸泡液接种到CCA或YTSA-CC半选择 性培养基，分别置25℃培养6d或28℃培养48h后观察菌落形态特征。挑取可疑菌落划线接种NA 纯化培养做进一步鉴定。 香蕉细菌性萎熹病菌菌体杆状，革兰氏染色阴性，单生极鞭；该病菌在CCA半选择性培养基上 上28℃黑暗培养48h后，呈现黄色、有光泽、圆顶形的黏稠状菌落，其直径为2mm～3mm；在NA平 板上菌落皇黄色、凸起、黏稠状。 5.2.2生理生化指标测定 将可疑分离物菌株进行生理生化指标测定，包括氧化酶、淀粉水解、硝酸盐还原、明胶液化等试验， 见附录C。或采用BIOLOG微生物鉴定系统替代。 香蕉细菌性萎焉病菌生理生化指标特征参见A.4。 5.2.3PCR检测 挑取经NA平板上28℃培养48h后的菌落或疑似病害组织提取DNA模板进行PCR扩增。用无 果，见附录D。 5.2.4MADLI-TOFMS检测 MADLI-TOFMS检测程序见附录E。 5.2.5致病性测定 如有需要，致病性试验采用注射方式接种。用一次性注射器吸人培养过夜的浓度为10°CFU/mL 的细菌悬浮液后，注射到3株～5株健康香蕉幼苗（组培幼苗最佳）植株上部幼叶或（假）茎基部。阴性 对照用无菌水代替接种液。接种后的植株放置在28℃～35℃温度下，先在100%相对湿度保湿 24h～48h，然后转移到80%左右的相对湿度下，每天70001x～100001x光照培养16h，黑暗培养 8h。接种后5d开始观察症状，7d～10d后植株表现出萎焉黄化、在（假）茎基部横切面出现乳白色、黄 色或者红色的菌脓黏稠分泌物视为感病，接种后40d不表现症状视为不发病。 6结果判定 分离纯化的菌株其菌落形态特征符合5.2.1，生理生化指标符合5.2.2，PCR检测结果为阳性或 MALDI-TOFMS检测结果为阳性，致病性试验表现典型症状，则判定为检出Xanthomonascampestris pv.musacearum；否则判定为未检出。