SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1486—2016 代替SN/T1486—2004 输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法 Detection of yellow fever virus in imported mosquitoes 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1486—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1486一2004《输人性蚊类携带的黄热病毒检测方法》。 本标准与SN/T1486—2004相比主要技术变化如下： 修改了“1标准的范围”； 修改和增加了“2规范性引用文件”； 增加了术语和定义“RT-PCR反应”“荧光RT-PCR反应”； 增加了“4缩略语”； 修改和增加了“5实验室生物安全要求”；将“5实验室生物安全要求”调整为“6生物安全 措施”，并修改了表述内容； 修改了结构和表述：划分了层次，分为“主要仪器和设备”、“主要试剂”、“检验程序”；将“6.1.1 器材”调整为“7仪器和设备”，并修改了表述方式和内容；将“6.1.2常用试剂”调整为 “8主要试剂”，并修改了表述方式和内容； 修改了内容和方法：将“6.2操作方法”调整为“9检验程序”，并修改了表述；增加9.3“荧光 RT-PCR检测方法”；删除“病毒分离与酶联免疫吸附试验检测方法”； 修改并增加了结果判定的细节：修改了“RT-PCR方法结果的判定”的表述；增加了“荧光RT PCR方法结果的判定”； -增加了废弃物处理； 删除了附录A。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：张升、周冬根、吴薇、郑剑宁、杨天赐、崔科军、胡群。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： 业标准信息服务平台 SN/T 14862004。 1 SN/T1486—2016 输入性蚊类携带的黄热病毒检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸输入性蚊类携带黄热病毒的检测对象、生物安全措施、仪器和设备、主要试 剂、检验程序、阳性结果处置和废弃物的处理。 本标准适用于输人性蚊类体内携带黄热病毒的实验室检验。口岸发现的蚊类携带黄热病毒检测可 参考本标准执行。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 输入性蚊类importedmosquitoes 通过入境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包等携带人境的蚊类。 3.2 黄热病毒yellowfevervirus 属于黄病毒科（Flaviuiridae）黄病毒属（Flavivirus)单股正链RNA病毒，与同属的登革热病毒等 有交叉免疫反应。病毒颗粒为直径37mm～50nm的球形，外有脂蛋白包膜，包膜表面有刺突。基因组 大小约为11kb，只含有一个长的开放阅读框架。 3.3 逆转录聚合酶链式反应 reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) 将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。本标准采用逆转录聚 合酶链式反应（RT-PCR）。在RT-PCR中，首先以RNA为模板，利用下游特异性引物，在依赖RNA的 DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步称作“逆转录”；随后，再以cDNA 为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增；最终使RNA分子 的某个特定区域（目的片段）被扩增达儿百万倍。 3.4 荧光RT-PCR反应 fluorescenceRT-PCR 实时荧光RT-PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规RT-PCR 的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个率 灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，利用Taq酶的5'-→ 1 SN/T 1486—2016 3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信 号，即扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bpbasepair：碱基对。 FAM6-carboxy-fluorescein：6-羧基-荧光素，一种荧光报告基团。 BHQ1BlackHoleQuencher-1：一种荧光淬灭基团 5检测对象 主要检测的输人性对象包括：伊蚊属埃及伊蚊（Aedesaegypti）和非洲伊蚊（Aedesafricanus），及 可能携带黄热病毒的外来输入性蚊种等。 6 生物安全措施 6.1检测工作中的个人防护参照GB19489。 6.2实验室应符合GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。 6.3使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。 7 仪器和设备 本方法使用的主要仪器如下： 超净工作台； Ⅱ级生物安全柜； 业标准信息服务平台 实时荧光定量PCR仪， PCR热循环仪； 恒温孵育仪； 普通台式离心机； 高速冷冻离心机（离心力可达20000× 电泳仪； 凝胶成像分析系统； 体视显微镜； 高压灭菌锅； 冰箱：4℃、-20℃和-70℃； 可调式微量加样器（10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头。 8主要试剂 本方法使用的主要试剂如下： 2