ZJATA 浙 江 测 试 团 体 标 准 T/ZJATA 0002—2020 2020 - 10 - 18 发布 2020 - 11- 18 实施 浙 江 省 分 析 测 试 协 会 发 布 保健食品中维生素 K2的测定 高效液相色谱法 Determination of Vitamin K 2 in health foods— High performance liquid chromatography method ICS 67.050 X10 全国团体标准信息平台 T/ZJATA 0002—2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1 部分： 标准化文件的结构和起草规则》 的规定起草。 本文件由浙江省分析测试协会提出并归口。 本文件主要起草单位：杭州娃哈哈科技有限公司。 本文件参加起草单位 : 浙江省疾病预防控制中心、 浙江公正检验中心有限公司、 杭州市 疾病预防控制中心、 杭州市食品药品检验研究院、 浙江方圆检测集团股份有限公司、 浙江华 才检测技术有限公司。 本文件主要起草人：赵志红、沈珊珊、汤鋆、陈青俊、金铨、伍勋、牛灿杰、周牡艳、 吴琴。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 T/ZJATA 0002—2020 1 保健食品中维生素 K 2的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件描述了保健食品中维生素K 2的高效液相色谱法检测方法。 本文件适用于脂肪含量>1%的保健食品。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 样品经脂肪酶酶解， 酶解液经皂化后用水 -正己烷体系萃取， 高效液相色谱 -二极管阵列 检测器检测，外标法定量。 5 试剂或材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 试剂 5.1.1 无水乙醇（ C2H5OH ）。 5.1.2 碳酸钾（ K2CO 3）。 5.1.3 正己烷（ n-C 6H14 ）。 5.1.4 异丙醇（ iso-C 3H7OH ）：色谱纯。 5.1.5 甲醇（ CH 3OH ）：色谱纯。 5.1.6 磷酸二氢钾（ KH 2PO 4）。 5.1.7 氢氧化钾（ KOH ）。 5.1.8 脂肪酶：酶活力 ≥30 U/mg 。 5.2 试剂配制 5.2.1 氢氧化钾溶液 （ 40% ） ： 称取 40g 氢氧化钾于 250 mL 烧杯中， 用 40 mL 水溶解， 冷却后，加水至 100 mL ，储存于聚乙烯瓶中。 5.2.2 磷酸盐缓冲液 （ pH 7.5 ） ： 溶解 54.0g 磷酸二氢钾于 300 mL 水中， 用 40% 氢氧化 钾溶液调节 pH 至7.5 ，加水至 500 mL 。 全国团体标准信息平台 T/ZJATA 0002—2020 2 5.3 标准品 维生素 K2（七烯甲萘醌， C46 H64 O2，CAS 号： 2124-57-4 ） ： 纯度 ≥98% ， 或经国家认 证并授予标准物质证书的标准物质。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 维生素 K2 标准储备液 （ 100 mg/L ） ： 准确称取 10 mg （精确至 0.1 mg ） 维生素 K2 标准品，用异丙醇溶解并定容至 100 mL 棕色容量瓶中。在 -20 ℃ 下避光保存，保存期 3 个 月。 5.4.2 维生素 K2 标准系列工作液：分别准确吸取维生素 K2 标准储备液 0.050 mL 、0.100 mL 、0.200 mL 、0.500 mL 、1.00 mL 、1.50 mL 、2.00mL 于10 mL 棕色容量瓶中，加异丙醇 定容至刻度，维生素 K2 标准系列工作溶液浓度分别为 0.50mg/L 、1.00 mg/L 、2.00 mg/L 、 5.00 mg/L 、10.0 mg/L 、15.0 mg/L 、20.0 mg/L 。临用前现配。 6 仪器设备 6.1 高效液相色谱仪：带二极管阵列检测器。 6.2 涡旋振荡器。 6.3 恒温水浴振荡器。 6.4 pH 计：精度 0.01 。 6.5 电子天 平 ： 感 量 1 mg 和0.1 mg 。 6.6 离 心 机 ： 转速 ≥6000 r/min 。 6.7 氮吹 仪。 6.8 超声波 振荡器。 6.9 研 钵 。 6.10 旋 转蒸 发仪。 7 样品 7.1 根据不同 的样品 形态进行 制样，样品避光保存，制样后 尽快 测定。 7.2 片 剂：取 20 片 试样，研 磨成粉状 。 7.3 胶囊 ：取 20 粒胶囊 ， 倾 出 内 容物， 混匀 。 7.4 颗粒 剂：取 10 袋 试样， 倾 出 内 容物， 混匀 。 8 分析步骤 8.1 试样溶液制备 全国团体标准信息平台 T/ZJATA 0002—2020 3 8.1.1 制备条件 处理过程应 避 免紫 外光 直接 照 射 ， 尽可能 避光 操 作。 8.1.2 酶解 准确称取经均质的试样 0.5 g~2 g （精确 到 0.001 g ）于 50 mL 离 心管中，加 入 5 mL 温 水溶解（ 植 物 油不需 加水 稀释 ）。加 入 磷酸盐缓冲液（ pH 7.5 ）5 mL ， 混匀 ，加 入 0.3 g 脂 肪酶，加 盖 ， 充 分涡旋 2 min~3 min 。 混匀 后， 置 于 35 ℃±2 ℃ 恒温水浴振荡器中振荡 2 h 以上 ， 使其充 分酶解。 8.1.3 提取 取出酶解 好 的试样，分别加 入 10 mL 乙醇 及 1 g 碳酸钾， 混匀 后加 入 10 mL 正己烷和 10 mL 水， 涡旋提取 10 min ，6000 r/min 离 心 5 min ， 或 将 酶解液 转移 至 150 mL 的分液 漏斗 中萃取提取， 静置 分 层 。 转移上清 液至 100 mL 旋 转蒸 发瓶中， 向离 心管中 再 加 入 10 mL 正 己烷。 重复操 作 1 次， 合 并 上清 液至 蒸 发瓶中。 8.1.4 浓缩 将蒸 发瓶 接入 旋 转蒸 发仪或 氮吹 仪 上 ，于 40 ℃ 水浴中 减压蒸馏 或 气流 浓 缩 至 近干 ，取 下 蒸 发瓶， 用 氮气吹干 。 用异丙醇分次溶解 蒸 发瓶中 残留 物并 转移 定容至 10 mL 容量瓶中， 摇匀 ， 0.22 μm 有 机 系 滤膜过滤 ， 滤 液 待进 样。 8.2 液相色谱参考工作条件 液相色谱参 考 工作 条 件 如 下： a） 色谱 柱 ： C18 柱 ， 柱长 150 mm ， 内径 4.6 mm ， 粒径 5 μm ，或 具同等性能 的色谱 柱； b） 流动 相：甲醇 ； c） 流速 ： 1 mL/min ； d） 柱 温： 35℃ e） 检测 波长 ： 254 nm ； f） 进 样量： 20 μL； 注 ：有些品牌 C18 柱保留时间过长，流动相中可适量加入异丙醇。 8.3 标准曲线制作 采 用外标标准 曲线 法 进行 定量。 将 维生素 K2标准系列工作液分别 注入 高效液相色谱仪 中， 测定相 应 的 峰面积 ， 以峰面积 为 纵坐 标， 以 标准系列工作液浓度为 横坐 标 绘 制标准 曲线 ， 计 算线性回 归方 程 。 标准溶液色谱 图见附录 A 。 8.4 试样溶液测定 在相 同 色谱 条 件下， 将 制备的试样溶液 进 样， 进行 高效液相色谱分析。 以 保 留时间 和光 谱 图 定 性 ， 峰面积 外标法定量， 根据线性回 归方 程 计 算 出试样溶液中维生素 K2的浓度。 9 试验数据处理 全国团体标准信息平台 T/ZJATA 0002—2020 4 试样中维生素 K2的含量按公 式 （1）计 算 ： X=
×  ……………………………………… （1） 式 中： X—— 试样中维生素 K2的含量，单位为 毫克每千克 （ mg/kg ） ； ρ—— 由标准 曲线得到 的试样溶液中维生素 K2的浓度，单位为 毫克每升 （ mg/L ） ； V—— 定容体 积 ，单位为 毫升 （ mL ） ； m—— 试样取样量，单位为 克 （ g）。 试样中维生素 K2的含量 根据产 品技术规 格表达 ，按公 式 （ 2）计 算 ： Y= ×  ×mi ……………………………………… （2） 式 中： Y—— 产 品技术规 格 中维生素 K2的含量，单位为