SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2398—2010 苹果丛生植原体检疫鉴定方法 Identification of candidatus phytoplasma mali 行业标准信息服务平台 2010-01-10发布 2010-07-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 行业 ，中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 苹果丛生植原体检疫鉴定方法 SN/T 2398-2010 * 服务平台 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：68523946 68517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×1230 1/16 印张0.75 字数14千字 2010年4月第一版 2010年4月第一次印刷 印数1-1600 * 书号：155066·2-20695 定价16.00元 SN/T 2398—2010 前 言 本标准部分采用EPPO植物检疫标准（PM7/62（1)），主要技术差异如下： 删除ELISA检测方法； 一删除指示植物鉴定方法； 一添加电子显微镜观察方法。 本标准的附录B、附录C、附录D为规范性附录，附录A为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准参加起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检 疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：黄新、牟海青、邓从良、杨旭光、张祥林、王有福、朱水芳。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T 2398—2010 苹果丛生植原体检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了苹果丛生植原体的检疫和鉴定方法。 本标准适用于进出境苹果苗木及接穗中苹果丛生植原体的检疫和鉴定。 2原理 2.1分类地位 苹果丛生植原体（CandidatusPhytoplasmamali，Appleproliferationphytoplasma，AP），软壁菌 门，柔膜菌纲，不需固醇菌原体目，不需固醇菌原体科，植原体属，16SrX植原体组。 2.2检测方法 其生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据 DAPI荧光染色方法操作简便、成本低，在本标准中作为一种初步筛选植原体的方法：PCR技术灵 敏度高、特异性好，RFLP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法，在本标准中PCR技术与 RFLP技术结合作为鉴定苹果丛生植原体的准确方法。 3器材和试剂 PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温 冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。 DAPI、PCR缓冲液、氯化镁、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等。 4检测鉴定方法 4.1症状观察 仔细观察苹果种苗、果实、叶片等，症状描述参见附录A。 4.2DAPI染色 选取幼嫩组织（新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4，6-二 基-2-苯基吲哚）染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号 表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均·故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。 4.3通用引物PCR凝胶电泳及RFLP检测 通用引物PCR凝胶电泳及RFLP检测见附录B 4.4特异性引物PCR凝胶电泳检测 特异性引物PCR凝胶电泳检测见附录C。 4.5植原体形态观察 5结果判定 5.1表现症状与A.1.1描述一致且DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为苹果丛生植原 体，但需通过5.2、5.3、5.4中任意方案进一步检测。 5.2在4.3检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，而且RFLP分析片段大小与描述相符，可 判定该样品携带苹果丛生植原体或16SrX组的植原体。 1