SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2754.4—2011 出口食品中致病菌环介导恒温 扩增（LAMP）检测方法 第4部分：单核细胞增生李斯特菌 Loop-mediated isothermal amplification detection method for pathogens in export foodPart 4:Listeria monocytogenes 业标准信息服务平台 2011-02-25发布 2011-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2754.4—2011 前言 SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》分为15个部分： 第1部分：金黄色葡萄球菌； 第2部分：大肠杆菌O157； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：单核细胞增生李斯特菌； 第5部分：副溶血性弧菌； 第6部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌； 第7部分：空肠弯曲菌； 第8部分：肺炎克雷伯氏菌； 第9部分：溶血性链球菌； 第10部分：产气荚膜梭菌； 第11部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌； 第12部分：溶藻弧菌； 第13部分：创伤弧菌； 第14部分：假结核耶尔森氏菌； 第15部分：阪崎肠杆菌。 本部分为SN/T2754的第4部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、中华人民共和国 吉林出人境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。 信息服务平台 本部分主要起草人：张体银、黄晓蓉、郑晶、李志勇、易敏英、程洁、谭志、罗雁非、曹以诚、王志强、 陈洵、凌莉、高东微。 I SN/T 2754.4—2011 出口食品中致病菌环介导恒温 扩增（LAMP）检测方法 第4部分：单核细胞增生李斯特菌 1范围 (LAMP)法。 本部分适用于出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.30一2010食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测单核细胞增生李斯特氏菌，所有培养物 4防污染措施 防止污染措施应符合GB/T27403的规定。 5缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Betaine：甜菜碱 Bst酶[BstDNApolymerase（largefragment）：BstDNA聚合酶（大片段） DNA（deoxyribonucleicacid）：脱氧核糖核酸 dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷三磷酸 EDTA（ethylenediaminetetraaceticacid)：乙二胺四乙酸 LAMP（loop-mediatedisothermalamplification）：环介导恒温扩增 TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚 virR：单核细胞增生李斯特氏菌致病因子编码基因 SN/T 2754.4—2011 6技术概要 根据单核细胞增生李斯特氏菌特有的靶序列irR基因（参见附录A）设计的两对特殊的内、外引 物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用Bst酶后启动循环链置换反应，在oirR基因序列后动互 补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色 液，即可通过颜色变化观察判定结果。 7试剂和材料 7.1引物：根据单核细胞增生李斯特氏菌特有的靶序列irR基因设计一套特异性引物，包括外引物1， 外引物2和内引物1，内引物2。 外引物扩增片段长度：216bp。 外引物1(F3,5'-3'):GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT 外引物2(B3，5-3）：ACAAGACTTCACCAATCCA 内引物1(FIP,5-3):CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG 内引I物2(BIP,5-3):TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG 7.210XThermoPol缓冲液含:0.2mol/LTris-HCl,0.1mol/L氯化钾，0.1mol/L硫酸铵，20mmol/L硫 酸镁，1%TritonX-100。 7.3dNTPs:每种核苷酸浓度10mmol/L% 7.5 硫酸镁（MgSO）：浓度150mmol/L。 7.6 BstDNA聚合酶：酶浓度8U/uL。 7.7 显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000X。 7.81 DNA 提取液:20 mmol/L Tris-HCl,2 mmol/L EDTA,1.2% Triton X-100(pH8.0)。 7.9阳性对照：单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株，或含目的片段的DNA。 7.101.5mL塑料离心管。 7.11单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒"，可选，参照试剂盒说明书操作。试剂盒组成及 使用注意事项参见附录B。 8仪器和设备 8.1移液器：量程0.5μL~10μL；量程10μL100μL；量程100μL~1000μL。 8.2高速台式离心机：≥7000g。 8.3水浴锅或加热模块：65℃土1℃和100℃土1℃。 8.4计时器。 1）由广州华峰生物科技有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如 果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2