SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4073—2014 芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法 Detection and identification of Xanthomonas campestris pv.mangiferaeindicae 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4073—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫 局、福建农林大学。 本标准主要起草人：王念武、黄伙水、陈劲松、沈建国、王宏毅、翁瑞泉、黄振、胡方平。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4073—2014 芒果细菌性黑斑病菌快速检测方法 1范围 本标准规定了芒果细菌性黑斑病菌Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae的检疫鉴定 方法。 本标准适用于进出境芒果的果实、叶片、枝条，组织繁殖材料中可能携带芒果细菌性黑斑病菌的检 疫鉴定。 2芒果细菌性黑斑病菌基本信息 学名：Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae 分类地位：变形细菌门（Proteobacteria），-变形细菌纲（Gammaproteobacteria），黄单胞菌目（Xan thomonodales），黄单胞菌科（Xanthomonodaceae），黄单胞菌属（Xanthomonas）、黑腐黄单胞菌（Xan thomonas campestris）、黑腐黄单胞菌芒果致病变种（Xanthomonas campestrispv.mangiferaeindicae) 传播途径：远距离传播主要靠带菌苗木、接穗和果实的调运。 其他信息参见附录A。 3方法原理 根据芒果细菌性黑斑病菌的致病基因hrpB特有碱基序列设计引物进行PCR扩增，并结合半选择 性培养基上的培养性状，对该菌进行检疫鉴定。 4 仪器设备和主要试剂 4.11 仪器设备 PCR仪、高压灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机、离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、电泳 仪、凝胶成像系统、天平（感量：0.001g）、高温干燥箱、震荡培养箱、生物安全柜、可调移液枪。 4.2主要试剂 半选择性培养基NCTM3和NA培养基试剂见附录B,PCR检测试剂见附录C 5检测鉴定方法 症状检查 仔细观察芒果的果实，叶片和枝条，症状描述参见附录A。 5.2 检疫样品的采集及制备 取有疑似症状的芒果果实、叶片、枝条等进行实验室检测鉴定。 1 SN/T 4073—2014 5.3特异性引物的PCR初筛 提取可疑样品DNA，采用特异性引物Xcm1/Xcm2进行PCR检测。设阳性对照、阴性对照和空白 对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录C。 5.4细菌分离培养 半选择性培养基NCTM3分离，取疑似症状的样品（参见附录A），用清水冲洗干净，晾干后用灭菌 的解部刀在病健交界处取一小块病变组织，悬浮于少量无菌水中，用无菌玻棒挤压，然后用接菌环蘸取 菌悬液，在NCTM3培养基（配制方法见附录B）、平皿上划线分离，28℃下恒温培养5d。挑取疑似单 菌落（圆形，乳白色，黏液状，中央隆起，边缘清晰，大小3.0mm～4mm），划线纯化四次后备用， 5.5分离菌株特异性引物PCR扩增确认 采用特异性引物Xcm1/Xcm2对分离疑似菌株进行PCR检测。设阳性对照、阴性对照和空白对 照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。具体操作和判定见附录C。 6结果判定 6.1在5.3特异性引物的PCR初筛中，若出现阴性结果，则判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌，若 出现阳性结果，继续5.4细菌分离试验。阳性、阴性结果的判定见附录C 6.2在5.4细菌分离的基础上，若未出现疑似菌落，则判定样品未携带芒果细菌性黑斑病菌，若出现疑 似菌落，则需5.5特异性引物PCR扩增继续判定。 6.3在5.5分离菌株特异性引物PCR扩增确认中，若出现阳性结果，则判定为样品带有芒果细菌性黑 斑病菌：若出现阴性结果，判定为样品未携带芒果细菌性黑斑病菌。阳性、阴性结果的判定见附录C。 7样品保存 7.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出的芒果细菌性过斑病菌的样品应保存于一20℃冰 箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌杀死病菌后方可做丢弃处理。 7.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为芒果细菌性过斑病闲的菌株·应妥善保存。将菌株接种于NA培养基 斜面上，28℃培养48h，然后4℃冰箱保存，或液体培养至对数生长期，加入20%灭菌甘油并混匀， 7.3结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签学。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。 2