SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4077—2014 齿兰环斑病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of odontoglossum ringspot virus 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4077—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫 局、厦门市植保植检站。 本标准主要起草人：陈青、黄峰、李彬、廖富荣、谢毅璇、陈红运、林石明。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4077—2014 齿兰环斑病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了齿兰环斑病毒检疫鉴定的免疫学和分子生物学检测方法。 本标准适用于可能带有齿兰环斑病毒的兰花苗及植物产品的检疫鉴定。 2 齿兰环斑病毒基本信息 学名：odontoglossum ringspot virus 缩写：ORSV 分类地位：烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的成员。 ORSV主要通过机械性传播，桃蚜能传毒。 详细资料参见附录A。 3 方法原理 根据齿兰环斑病毒与抗体之间的特异性反应，对兰花叶片进行ELISA检测；根据该病毒基因组特 性进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定 4仪器、设施及试剂 4.11 仪器与设施 酶联检测仪、电子天平（感量0.0001g）、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰 箱、普通冰箱、离心机等：微量移液器（2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）；酶联板、研钵 等；防虫温室。 4.2试剂 酶联检测试剂（见附录B),RT-PCR检测试剂（见附录C)，IC-RT-PCR检测试剂（见附录D)。 后息服务 5检疫与鉴定 5.1制样 观察样品，有症状（如：叶片畸形、花叶、斑驳等）的苗木编号单独检测。没有症状的分组并编号检 测，分组，10株为一组，采集的叶片分成两份，分别用于酶联检测和分子生物学检测，不足10株可每株 取样进行检测。 5.2检测方法 5.2.1双抗体夹心酶联免疫吸附检测（DAS-ELISA） 把制备的样品上清液加人已包被ORSV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品 1 SN/T4077—2014 平行加到两个孔中。设阴性对照和阳性对照（健康的植物组织作阴性对照，感染了ORSV的植物组织 作阳性对照），样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（叶片）应尽量与检测样品一致。 不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。 具体操作见附录B。 5.2.2RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对 照，感染ORSV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。 具体操作见附录C。 5.2.3IC-RT-PCR检测 3h或4℃冰箱中过夜，PBST缓冲液洗涤3～5次，去除残留溶液；向每个已包被抗体的离心管中加人 检测样品上清液100uL，25℃下放置2h～3h或4℃冰箱中放置过夜，PBST缓冲液洗涤3～5次，双 蒸水洗涤1次，去除残留溶液，加入下游引物进行反转录合成cDNA后，PCR扩增。健康的植物组织作 阴性对照，感染ORSV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。 具体操作见附录D。 6结果判定 样品是携带ORSV，否则不携带。 7样品保存、结果记录与资料保存 7.1样品保存 经检测确定携带ORSV的样品应在合适条件下保存，病叶冻干保存在一20℃或者一80℃冰箱中， 做好标记和登记工作。 7.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员 慧服务平台 的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片。 2