SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4283.3—2015 国境口岸微孔板基因芯片检测方法 第3部分：7种呼吸道病毒 Test method of microplate gene chip at frontier port- Part 3: Seven respiratory viruses 行业标准信息服务平台 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4283.3—2015 前 言 SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分： 第1部分；通用技术规程； 第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因； 第3部分：7种呼吸道病毒； 一第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型； 第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌； 第6部分：12种食源性致病菌。 本部分为SN/T4283的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、清华大学 深圳研究生院、珠海精标仪器有限公司。 本部分主要起草人：史蕾、马岚、林勤丰、顾大勇、刘君、刘春晓、赵芳、赵纯中、何建安、徐云庆、 李永进。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4283.3—2015 国境口岸微孔板基因芯片检测方法 第3部分：7种呼吸道病毒 1范围 SN/T4283的本部分规定了国境口岸A,B型流感病毒，副流感病毒I、IⅡ、Ⅲ型，呼吸道融合病毒 以及腺病毒共7种呼吸道病毒的微孔板基因芯片检测方法 本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对上述7种呼吸道病毒进行检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T2609国境口岸流感、副流感、呼吸道合胞病毒的酶联免疫吸附试验检测方法 SN/T2752.4—2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员 SN/T4283.1国境口岸微孔板芯片检测方法第1部分：通用技术规程 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 3 术语和定义 3.1 呼吸道病毒 respiratoryviruses 以呼吸道为侵人门户，先在呼吸道黏膜上皮细胞中增殖并引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织 器官产生病变的病毒统称。 3.2 腺病毒 adenovirus 一种无包膜的双链DNA病毒，对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，其呼吸道感染 级务平台 的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等。 4缩略语 SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。 IAV:A型流感病毒（influenzaAvirus) IBV:B型流感病毒（influenzaBvirus) PIV：副流感病毒（parainfluenzavirus） ADV：腺病毒（adenovirus） RSV：呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus） 1 SN/T 4283.3—2015 5生物安全防护要求 5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求。 5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4一2011的要求。 6主要设备和试剂 生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。 6.2主要试剂：呼吸道病毒微孔板基因芯片检测试剂盒或自行设置的呼吸道病毒微孔板基因芯片检测 试剂（相关引物及探针序列参见附录A)。 7检测流程 7.1样品核酸的提取 使用RocheHighPureViralNucleicAcidKit提取样品核酸，可同时提取样品中病毒RNA 和 DNA。 7.2RT-PCR扩增反应 7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置RT-PCR反应体系，或自行配置：每个样品进行两 管反应，取适量RNase-freePCR管，分别标示样品编号与管号。每个样品的1号管中配置25uLRT PCR反应体系：10X缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L)2μL，MgClz（25mmol/L)2μL，所有上下游 引物（各5μmol/L）混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μLAMV反转录酶0.25μL，模板核酸5μL， ddH,O11μL。每个样品的2号管中配置25μLRT-PCR反应体系：10X缓冲液2.5μL，dNTPs（各 5μmol/L）2μL，MgCl,（25mmol/L）2μL，PCR阳性对照上下游引物（各5μmol/L）混合液2μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，AMV反转录酶0.25μL，模板核酸5μL，阳性对照核酸（主要为细菌基因组 DNA)2μL,ddH,O 9 μL。分别振荡混匀,并轻微离心。 7.2.2将上述PCR反应管放人PCR仪，设定PCR反应程序：首先42℃反转录40min，然后94℃变性 5min；再94℃变性50s，50℃退火50s72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。 若需长期使用请置于一20℃保存。 7.3微孔板基因芯片杂交反应 7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至50℃。 7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇 动混合均匀后，分别取100μL加入微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反 7.3.3分别取每个样品的1号管和2号管PCR产物各5μL，混合后于PCR仪中95℃加热5min，待 PCR仪降温至4℃后取出并立即置于冰上备用 片杂交仪中50℃，振荡反应1h。 2