SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4283.4—2015 国境口岸微孔板基因芯片检测方法 第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、 柯萨奇病毒A16型 Test method of microplate gene chip at frontier port-Part 4:Enterovirus, enterovirus 71 and coxsackie virus A16 行业标准信息服务平台 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4283.4—2015 前 言 SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分： 第1部分：通用技术规程； 第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因； 第3部分：7种呼吸道病毒； 第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型； 第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌； 第6部分：12种食源性致病菌。 本部分为SN/T4283的第4部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国甘肃出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、珠海精标仪器有限公司。 本部分主要起草人：赵纯中、刘芳、黄恩炯、顾大勇、何建安、史蕾、刘春晓、赵芳、徐云庆、李永进。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4283.4—2015 国境口岸微孔板基因芯片检测方法 第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、 柯萨奇病毒A16型 1范围 SN/T4283的本部分规定了国境口岸肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型鉴别的微 孔板基因芯片检测方法。 本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇 病毒A16型的鉴别检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T2752.4一2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员 SN/T4283.1国境口岸微孔板基因芯片检测方法第1部分：通用技术规程 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 3术语和定义 SN/T4283.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肠道病毒 enterovirus 又称肠病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridae）的肠病毒属（Enterovirus），是一类具有相同的 形态结构和生物学特点、形态最小的单股正链RNA病毒。肠道病毒包括小儿麻痹病毒（polioviruses） 3个型，柯萨奇病毒（coxsackieviruses）A组23个型B组6个型，伊科病毒（echoviruses）31个型及肠道 病毒（enteroviruses)68型～72型。 3.2 肠道病毒71型enterovirus71 肠道病毒的一种，感染性强且致病率高，可经由肠胃道（粪-口、水、食物污染）或呼吸道（飞沫、咳嗽 或打喷嚏）传染，也可经由接触病人皮肤水泡的液体而受到感染。6岁以下儿童发病率最高，主要引起 手足口病，与柯萨奇病毒A16型（coxsackievirusA16）导致的临床症状极为相似，很难分辨，只能依靠 实验室的病毒检测技术来鉴别。 3.3 柯萨奇病毒A16型 coxsackievirusA16 肠道病毒的一种，是引起手足口病的主要肠道病毒，其导致的症状与肠道病毒71型极为相似。 1 SN/T 4283.4—2015 4缩略语 SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。 EV：肠道病毒（enterovirus） EV71:肠道病毒71型（enterovirus71） CoxA16：柯萨奇病毒A16型（coxsackievirusA16） 5生物安全防护要求 5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求。 5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4一2011的要求。 6主要设备和试剂 生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。 6.2主要试剂：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型微孔板基因芯片检测试剂盒或自行设置 附录A)。 7检测流程 7.1样品核酸的提取 使用RocheHighPureViralNucleicAcidKit提取样品中病毒RNA，具体使用方法参考试剂说 明书。 7.2I RT-PCR扩增反应 7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置RT-PCR反应体系，或自行配置25μLRT-PCR反 应体系：10×缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgCl（25mmol/L）2μL，所有上下游引物（各 5μmol/L）混合液2μL，TaqDNA聚合酶025μL，AMV反转录酶0.25μL，模板核酸5μL（含阳性对 照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA)，ddH,O11L，振荡混匀，并轻微离心。 7.2.2将上述PCR反应管放人PCR仪，设定PCR反应程序：首先42℃反转录40min，然后94℃变性 5min；再94℃变性50s，55℃退火50s72℃延伸50s，共35个循环：最后72℃延伸7min，4℃保存。 若需长期使用请置于一20℃保存。 7.3微孔板基因芯片杂交反应 7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至50℃。 7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇 动混合均匀后，分别取100L加微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反 应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。 7.3.3取样品PCR产物10μL于PCR仪中95℃加热5min，待PCR仪降温至4℃后取出并立即置于 冰上备用。 2