SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.11—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第11部分：雅致小克银汉霉 Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection—Part 11:Cunninghamella elegans 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4624.11—2016 前 言 SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分 第1部分：地衣芽孢杆菌； 第2部分：短小芽孢杆菌； 第3部分：巨大芽孢杆菌； 一第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌； 第5部分：β型溶血性链球菌； 一第6部分：金黄色葡萄球菌； 第7部分：沙门氏菌； 第8部分：志贺氏菌； 第9部分：致泻大肠埃希氏菌； 第10部分：淡紫拟青霉； 第11部分：雅致小克银汉霉； 第12部分：哈茨木霉； 第13部分：黄孢原毛平革菌； 第14部分：焦曲霉； 第15部分：解淀粉芽孢杆菌； 第16部分：类产碱假单胞菌； 第17部分：恶臭假单胞菌。 本部分为SN/T4624的第11部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、沈阳药科大学。 本部分主要起草人：李俊环、王秋艳、徐慰倬、贺瑞、张新元、王芳。 标准信息服务平台 1 SN/T 4624.11—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第11部分：雅致小克银汉霉 1范围 SN/T4624的本部分规定了入境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉的形态学鉴定、实 时荧光PCR检测方法 本部分适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验雅致小克银汉霉检测和鉴定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 主要试剂和培养基 3.1 实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。 3.2 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA)：见附录A中A.1。 3.3 马铃薯-葡萄糖液体培养基：见A.2。 3.4 CTAB缓冲液：见A.3。 3.5 蛋白酶K。 Tris饱和酚。 3.6 行业标准信息服务平台 3.7 三氯甲烷。 3.8 异戊醇。 3.9 异丙醇。 3.10 TE缓冲液（pH8.0）：见A 3.11 70%乙醇。 3.12 溴化乙锭。 3.13 DNA分子量标记：1000bpDNAladdei 3.14琼脂糖。 3.15 50XTAE缓冲液（pH8.5)：见A.5。 3.16RealMasterMix(2.5X，含ROX内参染料）。 3.17 20XProbe Enhancer Solution。 3.18液氮。 4主要设备和材料 4.1 电子天平（感量0.01g）。 4.2恒温培养箱：25℃土1℃。 1 SN/T 4624.11—2016 4.3 3恒温振荡器：25℃±1℃。 4.4恒温水浴锅。 台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 4.6 PCR超净工作台。 4.7 实时荧光PCR仪。 4.8 微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000μL。 4.9 高压灭菌锅。 4.10 电泳仪装置。 4.11 核酸/蛋白分析仪。 4.12 凝胶成像系统。 4.13 陶瓷研钵。 4.14 无菌培养皿：直径90mm。 4.15 灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。 4.16 接种棒、镍铬丝。 4.17 Eppendorf管和PCR反应管。 4.18 显微镜：物镜10×~100×。 5样品制备、培养 5.1无菌操作取1g（mL）样品加入到100mL无菌水中混匀，移取1环菌液连续划线接种5个PDA琼 脂平板，25℃土1℃条件下培养3d～5d，观察琼脂平板上的菌落特征。取样过程中，在样品旁边放置 1个PDA平板作为空白对照。 5.2挑取单菌落划线接种在PDA平板上，25℃士1℃条件下培养3d～5d得到纯化的菌株，进行形 态学鉴定。 5.3挑取符合形态学特征单菌落转人马铃薯-葡萄糖液体培养基中，25℃土1℃条件下180r/min振荡 培养3d~5d,获得菌丝体。 行业标 6鉴定特征 6.1培养性状 雅致小克银汉霉生长迅速，接种PDA平板，25℃培养3d后菌落直径为80mm左右，高10mm~ 15mm左右，表面长绒絮状，灰黑色，反面暗黄或深灰黑色。 6.2形态特征 囊轴倒梨形，项囊直径5.2um~12.5μm，小孢囊黑褐色，球形至椭圆形，表面粗糙，直径6.5μm~ (wrz'8~r89)X(r66~r08)r8 7分子生物学检测 7.1模板DNA的提取 7.1.1直接提取法 取5.3中菌液过滤抽干收集菌丝，取0.1g菌丝于液氮中研磨至粉末状，收集粉末于1.5mL离心管 2