SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.6—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第6部分：金黄色葡萄球菌 Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection—Part 6:Staphylococcus aureus 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4624.6—2016 前 言 SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分： 第1部分：地衣芽孢杆菌； 第2部分：短小芽孢杆菌； 第3部分：巨大芽孢杆菌； 一第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌； 第5部分：β型溶血性链球菌； 一第6部分：金黄色葡萄球菌； 第7部分：沙门氏菌； 第8部分：志贺氏菌； 第9部分：致泻大肠埃希氏菌； 第10部分：淡紫拟青霉； 第11部分：雅致小克银汉霉； 第12部分：哈茨木霉； 第13部分：黄孢原毛平革菌； 第14部分：焦曲霉； 第15部分：解淀粉芽孢杆菌； 第16部分：类产碱假单胞菌； 第17部分：恶臭假单胞菌。 本部分为SN/T4624的第6部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：李成镛、王婧、蒋施、刘瑜、侯彤言、付洋、王芳。 标准信息服务平台 1 SN/T 4624.6—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第6部分：金黄色葡萄球菌 1范围 SN/T4624的本部分规定了入境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的形态学鉴定、生 化鉴定、普通PCR、实时荧光PCR检测方法。 本部分适用于人境环保用微生物菌剂卫生学检验金黄色葡萄球菌的检测和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 主要试剂和培养基 3.1 实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。 3.2 生理盐水：见附录A中A.1。 3.3 7.5%氯化钠肉汤：见A.2。 3.4 血琼脂平板：见A.3。 3.5 Baird-Parker琼脂平板：见A.4。 3.6 脑心浸出液肉汤（BHI)：见A.5。 3.7 兔血浆：见A.6。 3.8 革兰氏染色液：见A.7。 3.9 营养琼脂小斜面：见A.8。 DNA分子量标记:100bpDNA ladder。 3.10 信息服务平台 3.11 dNTP:dATP、dTTP、dGTP、dCTP。 3.12 TBE:见A.9。 3.13 Taq DNA 聚合酶。 3.14 细菌基因组DNA提取试剂盒。 3.15 琼脂糖。 3.16 溴化乙锭。 4 主要仪器和设备 4.1电子天平（感量0.01g）。 4.2 恒温培养箱：36℃土1℃。 4.3恒温水浴锅。 4.4 台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 1 SN/T 4624.6—2016 4.5PCR扩增仪。 4.6实时荧光PCR仪。 4.7微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000μL。 4.87 高压灭菌锅。 4.9 PCR超净工作台。 4.10电泳仪。 4.11 核酸/蛋白分析仪。 4.12 凝胶成像系统。 4.13无菌培养皿：直径90mm。 5样品制备 以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混匀，从中移取25mL加人到225mL灭 6形态学及生化鉴定 6.1增菌 从上述样品匀液中取25mL加人到225mL的7.5%氯化钠肉汤的均质袋中混匀，于36℃土1℃ 培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。将上述培养物，分别划线接种到 18h～24h观察记录菌落特征，必要时可将培养时间延长至45h～48h。 6.2分离 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡 色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到 非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌 落所产生的黑色淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色 6.3染色、镜检 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径约为0.5μm～ 1 μm. 6.4血浆凝固酶试验 挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜 面,36℃±1℃培养18h~24h。 36℃士1℃恒温箱或水浴箱内，每30min观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈 现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球 菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI,36℃土1℃培养18h～48h，重复试验。 2