SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4631—2016 水仙普通潜隐病毒的检疫鉴定方法 Detection and identification of Narcissus common latent virus 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4631—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫 局、中国农业科学院生物技术研究所、中国检验检疫科学研究院、浙江省检验检疫科学技术研究院、福建 农林大学。 本标准主要起草人：沈建国、廖富荣、李敏、李为民、张永江、邵碧英、刘正才、吴颖、高芳銮、吴祖建。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4631—2016 水仙普通潜隐病毒的检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了水仙普通潜隐病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境水仙鳞球茎、植株中水仙普通潜隐病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T 2964 植物病毒检测规范 SN/T 3457 植物病毒分子生物学检测规范 3原理 水仙普通潜隐病毒（背景资料参见附录A)的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主 要依据。 4仪器设备、用具及试剂 4.1 仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平（1/1000g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、一20℃低温冰箱和一80℃ 超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶 标仪等。 4.2用具 各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μuL、10μL、2μL）、PCR反应管、无RNase Eppendorf离心管（1.5mL）、研钵、酶联板等。 4.3试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。酶联板捕获抗原 酶联免疫吸附测定法（Plate-trappedantigenELISA，PTA-ELISA）试剂见附录B、RT-PCR试剂见 附录C、实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D。 5抽样和样品制备 5.1抽样 尽量抽取有病毒危害症状的材料，NCLV的危害症状描述参见附录A；抽样方法按照SN/T2122 1 SN/T4631—2016 中规定执行。 5.2样品制备 分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行 6检测与鉴定 6.1PTA-ELISA 以含NCLV材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以样品提取缓冲液 作为空白对照，具体操作见附录B。 6.2 RT-PCR 以含NCLV材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以ddH，O代替模板 作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录 C。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 6.3实时荧光RT-PCR检测 以含NCLV材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作阴性对照，同时以ddH,O代替模板 作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测，具体操作见附录D。如 采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 结果判定与记录 7.1 结果判定 性时，则判定为检出水仙普通潜隐病毒。 当RT-PCR检测结果为阳性、测定的序列为水仙普通潜隐病毒序列时，则判定为检出水仙普通潜 隐病毒。 7.2结果记录 记录好各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人 和实验人员的签字。PTA-ELISA检测应有酶联反应数值；RT-PCR检测应有电泳图片；实时荧光RT- 心服务平 PCR检测应有扩增曲线图片。 8样品的保存 经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一20℃～一80℃超低温冰箱中，并作好登记和标记 工作，以备复核用。 2