SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4643—2016 线虫标本采集分离保存规范 Standards for sampling,detecting and preserving specimen of nematodes 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4643—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：顾建锋、陈先锋、张慧丽、何洁。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4643—2016 线虫标本采集分离保存规范 1范围 本标准规定了出入境植物检疫中线虫标本的采集、制作和保存方法。 本标准适用于出入境检验检疫部门对线虫标本的采集、制作和保存工作。 2方法原理 根据植物病原线虫不同的寄生方式，采集表现瘦瘤、叶斑、坏死、变色、畸形等症状的样品，或采集寄 主植物的根及根围土壤或介质，用改良漏斗分离法等分离线虫，然后浸泡保存或制作成永久玻片，达到 对线虫标本保存的目的 3 仪器、试剂和用具 3.1仪器 体视显微镜（10×以上，具透射光源）、恒温培养箱、移液器（20μL～200μL）、离心机（2000r/min 以上）、冷藏箱、天平、Fenwick漂浮器等。 3.2试剂 福尔马林（4%甲醛）、甘油、乙醇、蔗糖、封片剂（中性树胶、阿拉伯树胶、指甲油）、石蜡、溶液I（96% 基亚矾、氯化钠、氢氧化钠。 DESS溶液配制方法参见附录A 3.3用具 钟面皿或培养皿、细胞培养皿、盖玻片、载玻片、剪刀、线虫挑针、酒精灯、双层纸巾、线虫滤纸、纱布、 息服务平 500μL微量离心管、密闭塑料盒、漏斗、漏斗架、乳胶管、止水夹、加热板、筛网（10目、60目、300目、400目、 500目）、取样铲、塑料袋、水桶、记号笔等。 4样品采集 4.1 病变组织或土样的采集 植物病原线虫按寄生方式不同一般可分为内寄生和外寄生线虫。大多数寄生线虫危害寄主植物根 和地下茎，如根结属线虫Meloidogyne寄生于根内，孢囊属线虫Heterodera部分外露于根部。但也有 部分线虫（如粒属线虫Anguina、滑刃属线虫Aphelenchoides、伞滑刃属线虫Bursaphelenchus等）危害 植物地上的芽、叶片、茎杆、种子、穗部等。部分植物受线虫危害后，有时可表现瘦瘤、叶斑、环死、变色、 畸形等症状，但地上部分症状一般不显著 植物受线虫危害后，发生明显病变的部位，往往也是病原线虫存在的部位。如粒属线虫在籽粒虫瘦 1 SN/T 4643—2016 检测茎、块茎、叶中的线虫时，要注意观察植株花、叶、芽等是否有枯死、褐色角斑、矮小、畸形等受害 症状，块茎、鳞茎、球根等是否有干腐、变黑等症状。重点选取表现上述症状的花、叶、芽、块茎等植物 组织。 无论针对植物内寄生或外寄生线虫，应考虑把样品可能带有的土壤或介质作为取样重点。取样时 应用取样铲采集根系附近的土壤、介质，并尽量多采集根系，采集深度一般为土表下10cm～20cm。样 品的数目可考虑具体情况设置，一般每个样品重量为0.5kg左右。 4.2采集信息记录和编号 对于进口样品，需记录采集时间、采集地点、采集人、寄主等信息。对于国内采集的样品，还应记录 其经纬度和海拔等，必要时摄影存档。从采集的样品到最后的凭证标本、显微照片及DNA等，均需有 统一的唯一性标号相对应，可实现系统溯源。 4.3采集样品的保存 采集到的组织或土样等要防止干燥，写好标签后应立即放在塑料袋中，密闭袋口，避免阳光直射，及 时送实验室检测。如不能及时送检，可将样品置4℃～10℃冷藏箱贮存。 5线虫分离 5.1直接解剖法 该方法适用于分离孢囊属线虫、根结属线虫等内寄生线虫，以及粒属线虫等体型较大的线虫。其方 线虫，有时线虫游离到水中。用线虫挑针或移液器收集线虫或孢囊。 5.2直接浸泡法 Radopholus等。将病组织剪成小段或撕开，加清水，浸泡数小时后即有线虫游出，在体视显微镜下用挑 针或移液器收集线虫。 5.3贝曼漏斗法 该方法适合分离多数样品，但对土壤效果不佳。将10cm～15cm直径的漏斗固定在支架上，下端 接一段硅胶管或乳胶管，管的近末端用止水夹夹紧。将待分离的样品（剪成小段的叶片、茎、芽、花或破 碎的种子等）用纱布包好，轻轻放人盛有适量清水的漏斗（使样品略露出水面为宜）。20℃～25℃静置 24h~48h，打开止水夹，用培养皿或钟面皿接取线虫液5mL10mL，镜检。 5.4浅盘分离法 该方法系贝曼漏斗法的改进，能一次分离较多的样品，因筛网面积大，通气性好，能提高分离效率。 浅盘分离法装置由两只不锈钢浅盘和双层纸巾或纱布组成，上盘为10目的筛网，下盘为正常浅盘。分 离线虫时，将双层纸巾或纱布平铺在上盘的筛网上，然后将待分离的样品（介质，王壤、及剪成小段的叶 片、茎、芽、花、病残体或破碎的种子等）撒铺在表面，将筛网放在装有适量清水的底盘内（水量以刚好浸 透样品为宜）。20℃～25℃静置24h～48h后，移去筛网，用400目分样师收集线虫，然后将线虫液转 移到培养皿或钟面血，镜检。 2