ICS 11.100 SN C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5109—2019 国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋 恒温扩增检测方法 Polymerase spiral isothermal reaction methodfor Yersinia pestis at frontier ports 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5109—2019 前言 本标准根据GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国满洲里海关、中华人民共和国福州海 关、中国人民解放军疾病预防控制研究所。 本标准主要起草人：张晓龙、高艳菲、郭文秀、王静、黄恩炯、刘威、慈颖、刘丽娟、杨宇、黄留玉。 业标准信息服务平台 SN/T 5109—2019 国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋 恒温扩增检测方法 1范围 序、方法、结果判定及报告。 本标准适用于国境口岸鼠疫耶尔森菌疑似感染样本、啮齿动物、蚤等样本中鼠疫耶尔森菌的筛选 检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部） 3术语和定义 3.1 鼠疫耶尔森菌Yersiniapestis 分类上属原生生物界，原核细胞型微生物，革兰氏阴性兼性厌氧菌类，肠杆菌科，耶尔森菌属，假结 核耶尔森菌鼠疫亚种（Y.pseudotuberculosispestis）。鼠疫的病原菌.能够引发腺鼠疫、败血型鼠疫和 肺鼠疫，是生物战剂和生物恐怖的重要病原菌之一。F1抗原是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一， 其F1基因常作为鼠疫菌核酸检测的靶标 3.2 聚合酶螺旋恒温扩增反应polymerasespiralisothermalreaction（PSR） BstDNA聚合酶的链置换作用下，短时内扩增靶序列，形成螺旋扩增。大量合成目标DNA的同时，伴 随有pH的大幅下降，加入pH指示剂，可通过观察颜色变化判定结果；也可以加入荧光染料（例如： EveGreen），通过荧光PCR仪上的扩增曲线和溶解曲线来判定结果。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PSR：聚合酶螺旋恒温扩增反应（polymerasespiralisothermalreaction） 1 SN/T 5109—2019 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleotidetriphosphate） Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）(BstDNApolymerase(largefragment)) 5检测对象 检测对象包括： 国境口岸出现的不明样本和环境样本； 一啮齿动物及寄生蚤、洞干蚤等样本； 生物安全要求 实验过程中生物安全要求如下： 检测工作中按GB19489和WS233中相关要求做好个体防护 应遵循《人间传染的病原微生物名录》中的生物安全要求进行，鼠疫菌核酸检测应在生物安全 二级（BSL-2）实验室； 应遵循GB19489对废弃物的处理要求对废弃物品进行处理， 7 主要仪器与试剂 7.1 主要仪器 主要仪器设备如下： 式出版文 荧光PCR仪；或核酸扩增仪，或恒温扩增检测仪；或金属浴；或水浴锅：65℃±1℃；95℃土1℃。 标准 7.2主要试剂 使用的主要试剂如下： 多功能样品处理液：含5%Chelex-100，1%TritonX100的TE缓冲液（Tris10mM，EDTA 1mM）（具体配制方法参见附录A）； 鼠疫菌螺旋恒温扩增快速检测试剂盒：包括核酸免提取试剂（多功能样品处理管，含多功能样 品处理液），鼠疫菌PSR一滴法现场检测试剂盒?（具体方法参见附录B），鼠疫菌实时荧光 PSR检测试剂盒（具体方法参见附录C)； 引物：以鼠疫菌F1基因保守序列设计（GenBank号：X61996.1的）引物组，组成如下： FP:AAGTACATGGGATCACCCGCGCGGCTATAAAACAGGAAC BP:AAGTACATGGGATCACCCGCGCCACAATCTCTAGAATCCTTGCCAATC IF:GCATCTGTAAAGTTAACAGATGTGC 一dNTP：四种核苷酸，每种浓度均为10mM； Bst 酶:8 U/μL; 注1，2，3：试剂1、2、3由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果 其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2