SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2754.3—2011 出口食品中致病菌环介导恒温 扩增（LAMP）检测方法 第3部分：志贺氏菌 Loop-mediated isothermal amplification detection method for pathogens in export food-Part 3:Shigella 业标准信息服务平台 2011-02-25发布 2011-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2754.3—2011 前言 SN/T2754《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为15个部分： 第1部分：金黄色葡萄球菌； 第2部分：大肠杆菌0157； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：单核细胞增生李斯特菌； 第5部分：副溶血性弧菌； 第6部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌； 第7部分：空肠弯曲菌； 第8部分：肺炎克雷伯氏菌； 第9部分：溶血性链球菌； 第10部分：产气荚膜梭菌； 第11部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌； 第12部分：溶藻弧菌； 一 第13部分：创伤弧菌： 第14部分：假结核耶尔森氏菌； 第15部分：阪崎肠杆菌。 本部分为SN/T2754的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫 局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国江门出人境检验检疫局、广州华峰生物科 技有限公司。 信息服务平台 本部分主要起草人：郑文杰、刘伟、张宏伟、张霞、王志强、张海英、蔡国瑞、侯丽萍、李志勇、曾静、 孙慈惠、凌莉、曹以诚、高东微。 I SN/T2754.3—2011 出口食品中致病菌环介导恒温 扩增（LAMP）检测方法 第3部分：志贺氏菌 1范围 SN/T2754的本部分规定了检测出口食品中志贺氏菌的环介导恒温核酸扩增（LAMP)法。 本部分适用于出口食品中志贺氏菌的筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.5食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测志贺氏菌，所有培养物和废弃物应按照 行业标准信息服务平台 GB19489中的有关规定执行。 4F 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T27403的规定 5缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Betaine：甘氨酸三甲内盐 Bst酶[BstDNApolymerase(largefragment)]：BstDNA聚合酶（大片段） DNA（deoxyribonucleicacid)：脱氧核糖核酸 dNTP（deoxyribonucleosidetriphosphate）：脱氧核苷三磷酸 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)：乙二胺四乙酸 LAMP（loop-mediatedisothermalamplification）：环介导恒温核酸扩增 TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚 6技术概要 根据志贺氏菌属paH基因序列（参见附录A设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上 1 SN/T 2754.3—2011 的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ipaH基因序列启动互补链合成，在同一链上互 补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反 应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察 判定结果。 7试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 7.1引物：根据志贺氏菌属ipaH基因序列设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2和内引物1， 内引物2。 外引物扩增片段长度：193bp。 外引物2(B3,5'-3'):GAGGGTTTTCCGGAGATTGT 内引物1(FIP,5-3'):TTTCCAGCCATGCAGCGACCGATACCGTCTCTGCACGC 内引物2(BIP,5-3):CTCTGCGGAGCTTCGACAGCTCCTCACAGCTCTCAGTGG 7.2Bst DNA聚合酶。 7.3dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。 7.4DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒。 7.5TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1 mmol/L EDTA(pH8.0)。 7.6ThermoPol缓冲液：200mmol/LTris-HCl、100mmol/L氯化钾、20mmol/L氯化镁、100mmol/L 硫酸铵、1%TritonX-100(pH8.8)。 7.7硫酸镁:10mmol/L。 7.8甜菜碱：5mol/L。 7.9显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000X。 7.10阳性对照：志贺氏菌标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。 标准信 7.111.5mL塑料离心管。 8仪器和设备 忠服务平台 8.2高速台式离心机：≥7000g。 8.3水浴锅或加热模块：63℃±1℃和100℃土1℃。 8.4计时器。 9检测程序 食品中志贺氏菌LAMP检测程序见图1。 2