SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3306.7—2016 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第7部分:猴痘病毒 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port- Part 7:Monkeypox virus 行业标准信息服务平台 2016-06-28发布 2017-02-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3306.7—2016 前言 SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》共分为7个部分： 第1部分：鼠疫杆菌； 第2部分：产毒素霍乱弧菌； 第3部分：志贺氏菌； —第4部分：嗜肺军团菌； 第5部分：布鲁氏菌； 第6部分：黄热病毒； 第7部分：猴痘病毒 本部分为SN/T3306的第7部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：郑伟、吕沁风、吴忠华、罗鹏、徐琦、何蕾、李莉、沈若川、周健青、李禾、李洪波 行业标准信息服务平台 1 SN/T 3306.7—2016 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第7部分：猴痘病毒 1范围 SN/T3306的本部分规定了国境口岸猴痘病毒环介导恒温扩增检测方法。 本部分适用于国境口岸出人境人员或动物携带猴痘病毒的筛选检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2097入出境人员猴痘检验规程 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Bst：嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillusstearothermophilus） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid) LAMP：环介导恒温核酸扩增（loopmediatedisothermalamplification） Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris（hydroxymethyl）aminomethane-HCl TritonX-1oo：聚乙二醇对异辛基苯基醚[PolyethyleneGlycol Mono（p-1,1,3,3-tetramethyl 标准信 butyl)phenyl Ether] 4生物安全要求 所有有关猴痘病毒的实验室操作应按照以下规定执行： 猴痘病毒病毒培养或动物感染实验在生物安全三级（BSI-3或ABSL-3)实验室内进行； 猴痘病毒灭活材料的操作在生物安全二级（BSL-2)实验室内进， 猴痘病毒相关的无感染性的材料操作在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行： 猴痘病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。 5对象 疑似感染猴痘病毒的出人境人员。 5.2 疑似携带猴痘病毒的出人境动物。 1 SN/T 3306.7—2016 6技术概要 根据猴痘病毒基因保守序列设计两对内、外引物，识别靶序列上的六个独立区域，利用BstDNA聚 合酶启动循环链置换反应，启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构 的茎-环DNA混合物；从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸 镁）形成乳白色沉淀，离心即可通过白色沉淀是否产生观察判定结果。 7试剂 在实验过程中需要以下试剂： 引物：位于猴痘病毒基因组48332bp~48780bp（参见附录A），组成如下： ·外引物1(F3):5²-CATTGATTTTTCGCGGGATA-3'; 外引物2(B3):5²-TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3; ·内引物 1(FIP):5’-GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT 3'; 内引物2(BIP):5-TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGA TCTATATTGACGAG-3'; ·环引物(LP):5'-CGTTCTGACACAGAGATTGTGTG-3’。 BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL； dNTPs:dATP、dGTP,dTTP,dCTP各 10 mmol/L; DNA提取试剂盒； Tris-HCl:500 mmol/L; MgSO4:8 mmol/L; 甜菜碱：8mmol/L； (NH,),SO4:100 mmol/L; 业标准信息 KCl:500 mmol/L; Triton X-100:10%。 8仪器设备 在实验过程中需要以下仪器设备： 收务平台 普通台式离心机； 高速台式离心机：≥10000g； 水浴锅或加热模块； 70℃超低温冰箱； 计时器。 9检测程序 猴痘病毒LAMP检测程序见图1。 2