SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3884—2014 国境口岸蜱类携带新布尼亚病毒 SYBRGreen荧光PCR检测方法 Detection of tick-borne novel Bunyavirus by SYBR Green PCR method at frontierport 行业标准信息服务平台 2014-01-13发布 2014-08-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3884—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、军事医学科学院、中华人民共和国农业 部规划设计研究院。 本标准起草人：田洁、刘艳华、王艺凯、郭慧琳、江佳富、贾娜、叶锋、孔箐锌、蒋宝贵、张丽杰、任彤 行业标准信息服务平台 SN/T 3884—2014 国境口岸蜱类携带新布尼亚病毒 SYBRGreen荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸蜱新布尼亚病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括标本采集、处理、 检测程序、结果判定及报告。 本标准适用于国境口岸蜱携带发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的实验室检验。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1293国境口岸蜱类监测规程 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 人间传染的病原微生物名录中华人民共和国卫生部2006年 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 新布尼亚病毒newbunyavirus 发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒（Severefeverwiththrombocytopeniasyndromebunyavirus， SFTSV），简称新布尼亚病毒，是我国新发现的一种布尼亚病毒，属于布尼亚病毒科白病毒属，为分节 段的负链RNA病毒。病毒颗粒呈球形，直径80nm～100nm，外有脂质包膜，表面有棘突。该病毒引 起新发传染病发热伴血小板减少综合征，临床上主要表现为发热、血小板和白细胞减少、消化道症状及 多脏器功能损伤。 3.2 SYBRGreen荧光定量PCR法 在PCR反应体系中，加人过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性的掺DNA双链后·发射 荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 4.1RT-PCR逆转录聚合酶链式反应。（reversetranscriptionpolymerasechainreaction） 4.2Ct值循环阈值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。（cyclethreshold） 4.3RNA木 核糖核酸。（ribonucleicacid） 1 SN/T 3884—2014 4.4PBS缓冲液含0.5%吐温-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液。 实验室生物安全要求 中华人民共和国卫生部发布的《人间传染的病原微生物名录》规定，布尼亚病毒危害程度分类为第 三类，所有有关布尼亚病毒的实验室操作应按照以下规定执行： 一布尼亚病毒培养和动物感染实验应在生物安全二级（BSL2或ABSL2）实验室内进行； 一未经培养的布尼亚病毒感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL2）实验室内进行； 布尼亚病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL1）实验室内进行； 一布尼亚病毒感染性材料运输包装分类为B类（仅培养物为B类），UN编号为UN3373； 一其他要求按GB19489和WS233进行。 6检测对象 6.1出入境交通工具、集装箱、货物等场所采集的游离蜱或从上述场所宿主体表采集的寄生蜱。 6.2口岸地区采集的游离蜱或从上述地区宿主体表采集的寄生蜱。 7试剂 7.1标本处理液：在新鲜配制的95mLMEM中加人56℃热灭活30min的胎牛血清2mL、1mL庆 大霉素（5000μg/mL）、1mL两性霉素B（250μg/mL）和1mL青链霉素（青霉素G10000U/mL、链霉 素10000μg/mL），用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH7.2。 二钠（NazHPO·H,O)0.06g，加水至1000mL。Hanks液可以高压灭菌，分装于4℃下保存。 7.3裂解液：Trizol-reagent或其他等效产品 标准信 7.4三氯甲烷。 7.5异丙醇。 7.6 75%乙醇。 7.7病毒RNA提取试剂盒。 服务平台 7.8 OneStepSYBR?PrimeScript?PLUSRT-PCRKit?，宝生物工程（大连）有限公司产品 7.9无RNase水。 7.10引物。 阳性对照：布尼亚病毒cDNA或含布尼亚病毒目的基因的质粒。 7.12 阴性对照：不含布尼亚病毒的蜱cDNA。 8 主要仪器设备 8.1实时荧光PCR仪。 8.2二级生物安全柜。 8.3高压灭菌器。 1)、2） 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效 果，则可使用这些等效产品。 2