ICS 65.100 CCS B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3853—2021 猪殃殃对乙酰乳酸合成酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程 Technical code of practice for detection the target-site resistance of Galium spurium Linn. to acetolactate synthase inhibiting herbicides 行业标准信息服务平台 2021-11-01实施 2021-05-07发布 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3853—2021 全国农前食品标准 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口 本文件起草单位：中国农业科学院植物保护研究所 本文件主要起草人：崔海兰、李香菊、陈景超、李政、彭立存、郭小桐。 PUBLI 中 服务平台 NY/T3853—2021 猪殃殃对乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程 1范围 本文件规定了猪殃殃（Galium spuriumLinn.）[异名GaliumaparineLinn：var.tenerumGren.et （Godr.）Rebb.对乙酰乳酸合成酶（acetolactatesynthasc，ALS)抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程 的基本要求以及注意事项。 本文件适用于猪殃殃对乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂产生靶标抗性的有关检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T1667—2008农药登记管理术语 NY/T1859.4农药抗性风险评估第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估 NY/T3285—2018播娘蒿对乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程 3术语和定义 上述引用文件中界定的术语和定义适用于本文件。 4检测程序 4.1材料培养 选择无猪殃种子、无除草剂残留的农田地表土，混合20%～30%的草炭土，混合均匀后装入直径不 小于10cm的培养钵；待测种群及敏感对照种子用0.05%~0.1%的赤霉素溶液浸泡12h~24h后冲洗 干净（或其他打破休眠处理），均匀撒播在土壤表面，覆土约1cm，采用盆钵底部渗灌方式补充水分，土壤 相对湿度保持在60%~70%；置于25℃：15℃（D：N），光周期12h：12h（L：D）条件下培养。待猪殃 殃长至2叶期，间苗，每盆保留长势一致的10株。 4.2生物测定 待植株长至3叶期，用待测除草剂（ALS抑制剂类除草剂）进行茎叶喷雾处理，药剂处理至少设置5 个剂量，每个剂量不少于4次重复，每个重复10株。施药21d后，调查每个处理的存活植株数、地上部分 鲜重或干重，按公式（1）计算杂草株防效、鲜重或干重抑制率。 Y- (1) Mo 式中： Y 株防效、鲜重或干重抑制率，单位为百分号（%）； M 除草剂有效剂量Xga.i./hm处理后存活植株数、地上部分鲜重或干重的数值，单位为株或 克(g); Mo 对照总株数、地上部分鲜重或干重的数值，单位为株或克（g）。 以杂草株防效、鲜重或干重抑制率为指标，按公式（2计算生长抑制中量。 D-C Y=C+ (2) 1+(X/GRs0） 式中： Y 株防效、鲜重或干重抑制率，单位为百分号（%）； 1 NY/T3853—2021 C Y值下限，单位为百分号（%）； D Y值上限，单位为百分号（%）； x 除草剂有效剂量的数值，单位为克每公项（ga.i./hm）； GR 50 生长抑制中量的数值，单位为克每公项（ga.i./hm）； 斜率。 b 按公式（3）计算抗药性倍数RI。 GR50R RI : (3) GRsos 式中： RI 抗药性倍数： GR50R 抗药性种群生 长抑制中世的数值，单位头 /hm²); 克每公（ga. GR50s 4.3靶标基因检测 4.3.1DNA提取 200mg 取杂草幼嫩 商品化试剂盒提取总DNA。 于10株，并单株检 滑晰 用1%琼脂糖凝胶电泳 金测提取的 DNA质计 香合桥电泳出现 斤明亮的条带，表明DNA S S 较完整，无降解 DNA样品的纯度及浓度检测：用分光光度计测定DV人咨液在260mm 光值 1(OD260)。OD260 ARCH 等于1时，样品中 DA 浓度为50g/按公 计TNA浓度 R C OD AX50 ..(4) 式中： U CDNA ONA浓 度单位为微克每 OD260 ONA容 在266m处的 A 希释音 通过测定 A浴液在 和O 纯度OD260/OD280 在1.7~2.0之间， 度符 全要求的DNA样品用十后 经过电泳和吸 检测 4.3.2聚合酶链式反 应（PCR） 用引物对：5'-A CACCATC TIGTT S和TCOCATO TCO GTAATC-3'，特异性扩 C 大小为 已知猪殃ALS 列（GenBank上的登记号为 增猪殃殃ALS，扩增 GU377313)设计特异性引物 PCR反应体系如下：2.5mmol/L的dNTP混合液2μL,10×PCRBuffer2.5μL,10μmol/L的引物 各0.5μL,5U/μL的TaqDNA聚合酶0.5 提取的待包A样品1L，加人18L无菌蒸馅水至反 应体系为25L。PCR反应条件如下：95C加 nin，使DNA裂解变性；进人反应循环，在每一个循环 中，95℃裂解30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃延伸5min，使产物延伸完整。 PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，与DNA分子量标准品比对，判断产物片段大小与预期是 否相符，根据条带亮度和有无杂带，判断产物浓度和扩增特异性。 4.3.3PCR产物测序 PCR产物的电泳检测结果符合预期时，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对产物进行回收纯化，纯化 后的PCR产物测序，测序引物采用扩增目的片段的引物。 5结果分析 5.1剂量反应曲线结果分析 2